33株H9N2亚型禽流感病毒分离株分子流行特点的研究

吴海燕 ，李明义 ，，范根成 ，王述柏 ，单 虎 ，刘拂晓

（1.青岛农业大学，山东 青岛 266109；2.青岛易邦生物工程有限公司，山东 青岛 266032）

禽流感病毒属正黏病毒科，是分节段、单股负链RNA病毒。病毒基因组共编码十种蛋白，其中血凝素蛋白（HA）是病毒最重要的保护性抗原，可诱导产生中和抗体。AIV存在广泛的抗原漂移和抗原转变现象，抗原性变异是流感病毒最显著的特点之一，其中HA基因突变频率最高，因此对HA基因的研究是对流感病毒抗原性和遗传性研究的重点。

世界禽流感的防制经验表明，疫苗免疫是预防和控制H9亚型禽流感暴发的有效措施和主动性战略。但是因H9亚型禽流感直接引发的死亡率相对较低，在我国未能引起足够的重视，造成其未能得到控制而广泛传播、流行。虽然低致病性禽流感直接致死率较低，但若与其他病原微生物如大肠杆菌发生混合感染，则能显著提高病毒的致病力，给养禽业带来严重危害。本实验室自1998到2007年这十年间，分离得到了我国不同地区、不同宿主来源的H9N2禽流感病毒，应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增HA基因，获得33株H9N2亚型禽流感病毒的核苷酸序列。结合GenBank中公开发表的其他国内H9亚型禽流感HA基因序列共65株，应用DNAstar软件进行分析，绘制系统发育进化树，从分子角度对近些年来H9N2禽流感病毒在我国的流行规律进行总结和分析。

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1 材料方法

1.1 病毒

H9N2亚型禽流感病毒分离株由本实验室与中国动物卫生与流行病学中心合作，从我国湖南、湖北、山东、云南、广西、安徽、辽宁、福建、山东、河南、浙江等地分离所得（表1）。

1.2 RT-PCR鉴定及序列比对分析

应用DNAStar软件，参照Gen-Bank中H9N2亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因序列，设计引物扩增HA基因，引物序列如下：P1：5'-ATGGAAACA GTATCACTAAT-3'；P2：5'-TATATACAAATG TTGCATC-3'。

PCR扩增程序：94.5℃预变性2min；94.5℃30s，55℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸9min。将扩增得到的HA基因送交大连宝生物公司进行序列测定。根据序列测定结果，与GenBank中发表的H9N2亚型禽流感序列进行同源性比对。

2 结果与分析

我们对33个分离病毒进行RT-PCR检测，扩增产物的电泳结果与预期相符，进一步验证了所分离毒株为H9N2亚型禽流感病毒。结合Gen-Bank中公开发表的其他国内H9亚型禽流感HA基因序列共65株，应用DNAstar软件进行分析，绘制系统发育进化树，进行H9亚型禽流感病毒谱系全景分析（图1）。

通过比较发现，同一时间、区域毒株并不只集结在一个系列当中，而是零星地散布于不同的系列不同的分支当中，如山东省2007年、2008年所分离到的10株毒株，通过核苷酸序列同源性的比对，它们相互之间的核苷酸同源性在88.9%～99.7%，最大差异值为10.8%，显示出在同一时间，同一地区所分离毒株的同源性差异较大。将辽宁2007年分离株与云南2006年、2007年分离株的核苷酸同源性比较发现，最大差异值为13.2%，最低同源性为86.8%。分离自我国华东地区各省份，如安徽的4株H9亚型禽流感毒株 ck/ah/D16/07，ck/ah/AK13/08，ck/ah/AL16/08，ck/ah/CXD/08，相互之间的核苷酸同源性在92.2%～96.4%，显示出在同一时间，同一地区所分离毒株的同源性差异较大；将广东2003年分离株ck/gd/11/03与广东2007年分离株ck/gd/02/07以及广东2008年分离株ck/gd/GZ02/08相比较，同源性在91.8%～95.0%之间，且分布在不同的系列，这一结果又显示同一地区的分离株，随着时间的推移，毒株之间的同源性也发生着一定的变化。

总结HA基因系统发育进化树分析的结果，发现有以下特点：

2.1 H9N2亚型禽流感在较广的区域内流行存在

从图1可以看到所划分的基因进化树大致可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三个系列，这三个系列分支间病毒同源性很低，三个系列覆盖了我国辽宁、安徽、山东、广东、福建、江苏、河南、湖南、湖北、上海、广西、云南、四川、新疆等绝大部分地区。

2.2 三个系列分支覆盖的毒株范围广泛，没有明显的地域分布差异

从基因进化树可见，Ⅰ系列分支中 ，ck/zj/ZC28/07，ck/zj/ZG1/07，ck/fj/11/07，ck/fj/08/07，ck/sd/mh-D2/07，ck/sd/D11/07，ck/ah/D16/07等毒株的地域来源广泛，分布于山东、浙江、安徽等省市，病毒来源广泛，没有明显的地域差异。第Ⅱ系列分 支包含 ck/sd/lx08，ck/sd/lx06/07，ck/sh/1/98，ck/hb/C1/07，ck/nj/13/03，ck/gx/H1/06，ck/gx/B1/06，ck/sh/16/01等来自山东、上海、南京、广西等地。第Ⅲ系列分支也是同样的情况。

2.3 同一系列分支包含的毒株时间跨度大，没有明显的时间分布规律

从基因进化树可见，同一系列分支中包含的分离毒株来自不同的年代，各系列分支与禽流感毒株的分离时间没有相关性。如，山东年分离株ck/sd/mh-D2/07，ck/sd/lx06/07，ck/sd/lx929/07，ck/sd/lx503/07，ck/sd/bs1210/07，上海 1998、2001年分离株 ck/sh/1/98，ck/sh/16/01，安徽2007、2008年分离株 ck/ah/D16/07，ck/ah/AK13/08，ck/ah/AL16/08，ck/ah/CXD/08，福建 2007、2008年分离株 ck/fj/11/07，ck/fj/08/07，南京2003年分离株ck/nj/13/03，散布在分别独立的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系列的各级分支中。不同时间的流行毒株可能分属于不同的系列分支。

2.4 毒株流行背景复杂，随着时间推移和地域转变，同源性的差异明显

同一地区在不同时间流行的毒株同源性差异显著，表明毒株随着时间的改变而不断发生变异。长江中游、洞庭湖以南的湖南省2007分离到的3株毒株ck/hu/HG29/07，ck/hu/HB5/07，ck/hu/d14/07分别散步在第Ⅰ系列的各级分支中，与分布在第Ⅲ系列的分支中的长江中游、洞庭湖以北的湖北省的部分分离株ck/hb/8/03，k/hb/L1/07的同源性差异很大，地域跨度不大，分离到毒株的亲缘关系却很远。另外，同一时间内不同区域流行的毒株变异也很大，表明随着地域的不同，毒株也发生不同程度的变异。

3 讨论

H9亚型禽流感属于低致病性疫病，但与其他病原特别是大肠杆菌混合感染能够提高其致病力，引起产蛋量严重下降和死亡率显著提高，给养禽业带来严重的危害。因此及时调查疫病的发生情况，及早预警潜在的流感病毒的威胁，为研制有效疫苗提供科学依据。

从所划分的基因进化树来看，大致可分为三个系列，这三个系列毒株分布没有明显的地域特点，同一时间段内全国流行多系列的毒株，同一地区可同时流行三个系列毒株；而且，每个系列中的毒株也没有明显的时间分布，同一系列分支中包含的毒株时间跨度很大。

H9亚型禽流感疫苗已在我国广泛使用，但同一地点可能存在遗传差异较大的不同系列分支的毒株流行，导致使用单一系列毒株制备的疫苗很难控制多系列毒株的流行，因此研制H9亚型多价苗是我国禽流感防控势在必行的趋势。

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