发酵芝麻饼粕中木脂素提取条件的优化及特征物质的鉴别

邵元龙,董 英

江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013

芝麻作为一种贵重的油料作物,木脂素类化合物是其特征成分,在芝麻中含量为 0.5% ～1.0%[1]。酚类木脂素是重要的组成部分,含量约0.3%～0.5%,主要有为:芝麻素、芝麻素酚、芝麻林素、芝麻林素酚、芝麻酚。最新的研究表明,在制油过程中产生的副产品芝麻饼粕中仍然含有一定量的芝麻木脂素类化合物[2],近年来,有关芝麻木脂素的分离纯化、流向、以及生理功能研究取得了较大的进展[3],如对芝麻素[4,5]、芝麻酚[6]、芝麻素酚[7]等的研究。

应用现代生物技术方法寻找新抗氧化剂的途径前景广阔,2007年,董英[8]用酱油曲霉发酵芝麻饼粕,发现可以提高其抗氧化活性,而对发酵后木脂素的提取条件和发酵组分变化并未深入探讨。为此,本文仍选用该菌株对芝麻饼粕进行发酵,以抗氧化活性为指标,对提取条件再优化。并对发酵后产生的新物质进行了分离和鉴别,为进一步开发利用芝麻饼粕奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料与仪器

菌株:酱油曲霉(Aspergillus sojae),CICC 2128:购自中国工业微生物菌种保藏中心;芝麻饼粕由江苏镇江京友调味品公司提供;二苯代苦味肼基自由基(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):购自美国Sigma公司。

JJ-1型电动搅拌器:江苏金坛医疗仪器厂;LD5-10离心机:北京医用离心机厂;YM50A电热蒸汽压力灭菌器:上海三申医疗器械有限公司;PSX智能型恒温恒湿培养箱:宁波来福科技有限公司;WFJ-7200可见分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司;LC-20AT高效液相色谱:日本岛津公司;CS9301(PC)薄层扫描仪器:日本岛津公司。

1.2 发酵方法

酱油曲霉接种于土豆汁(PDA)斜面培养基上,28℃培养 72 h后,加入 10 mL无菌生理盐水,用接种针刮下,调节菌液浓度为 0.86×108cfu/m L。取10 g烘干的脱脂芝麻饼粕加入 9m L蒸馏水,于 121℃灭菌 20min,冷却后,接种 1mL制备好的种子悬液,摇匀,于 28℃条件下发酵 144 h。

1.3 提取工艺优化方法

1.3.1 正交优化试验设计

在多次单因子对比试验基础上,选择提取溶剂乙醇浓度(A)、提取时间(B)、总乙醇体积与芝麻饼粕质量比(液料比)(C)和提取次数(D)4个因素,考察 4因素对自由基清除率的影响,试验因素水平见表 1。发酵结束后,按试验设计方案加入提取液,于 50℃水浴搅拌提取,转速 150 r/min。提取液于5000 r/m in离心 10 min。上清液经浓缩或添加提取液,统一定容至 150 mL。对提取液的自由基清除率进行测定和分析。

表1 正交试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels in Orthogonal design

1.3.2 响应面优化试验设计

在探讨了乙醇浓度、提取时间、液料比和提取次数对提取物抗氧化活性影响的基础上,初步优化出3个主要影响因素。根据 Box-Behnken中心组合试验设计原理,以提取时间、液料比、乙醇浓度为自变量,自由基清除率为响应值,对这 3个因素进一步优化,设计了三因素三水平的响应面分析试验,试验的因素和水平取值见表 2。发酵条件和提取液处理条件与正交试验一致。

表 2 响应面试验因素水平表Table 2 Factors and levels in Response Surface design

1.4 DPPH自由基清除活性测定(Radical Scavenging Activity,RSA)

取定容的发酵提取液 1mL,用 50%的乙醇稀释10倍,作为样品液。DPPH溶液浓度为 7.5×10-6mol/mL,波长 517 nm,50%乙醇为对照。测定清除DPPH自由基的活性,测定方法参考[9]。

1.5 HPLC检测木脂素提取液

发酵及未发酵提取液经 0.45μm膜过滤,进样量 10μL,LC-20AT,Shimadzu,Japan;柱径:Shim-Pack VP-ODS,250 mm×4.6 mm,5 μm;流动相 ∶甲醇∶水 =70∶30(v/v);流速 ∶1.0 mL/m in;柱温 30℃;检测器及波长:SPD-20A,波长 287 nm为检测波长,以芝麻素、芝麻林素标准品做外标。

1.6 特征物质分离纯化及鉴别

1.6.1 特征物质的分离纯化

采用硅胶柱层析分离,湿法装柱,干法上样,不同梯度的石油醚、石油醚/乙酸乙酯、乙酸乙酯洗脱。并用薄层色谱法检测,将含有特征物质成分的洗脱液合并,适当浓缩后自然挥干溶剂析出晶体。

1.6.2 薄层色谱检测(TLC)

将点样的薄层玻板置于层析缸(环己烷∶乙醚∶乙酸乙酯 =20∶3∶3,v/v/v)中展开。自然晾干后进行薄层扫描。步长 0.04min、光斑大小 1.0×5.0 mm、起始 X:17.0 mm、起始 Y:22.0 mm、结束 Y:98.0 mm、列间距 18mm、检测波长:287 nm、测光方式:反射、摆幅宽:1.0mm。

1.6.3 质谱技术(LC-MS)

Agilent 1100 LC-MSD,American;鞘气流速 11 L/min;喷射压:35 psig;温度 350℃;毛细管电压 4 kV;质量扫描范围 m/z200～800;负离子源喷射。

2 结果和讨论

2.1 芝麻饼粕木脂素提取条件的优化

2.1.1 正交优化试验结果

从表 3可知,影响抗氧化物提取率因素的主次为 A＞C＞B＞D,即乙醇浓度对提取率影响最大,其次为液料比和提取时间,最弱的为提取次数。乙醇浓度为 60%时,提取物的平均自由基清除率为71.46%,浓度高于 80%时的平均清除率为69.02%,但无显著的差异,提取次数之间差异微弱。从提取过程可操作性及经济学考虑,提取溶液体积和浓度,都应尽可能减小,且采用单次提取。

表 3 正交试验设计L9(34)及结果Table 3 Design matrix and experimental results of Orthogonal

2.1.2 响应面优化试验结果

响应面试验设计和结果见表 4,对所得数据采用 Desigh-Expert7.0 Trial软件中的 RS(response surface)程序进行分析,应用 Model Graph程序作响应曲面图和等高线图。

经回归拟合,获得 Aspergillus发酵芝麻饼粕提取物抗氧化活性对自变量提取时间、液料比和乙醇浓度的二次多项回归方程为:RSA%=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2

表 4 响应面试验设计和结果Table 4 Design matrix and experimental resu lts of Response Surface

模型方差分析见表 5,试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性(P＜0.0001),失拟项不显著(P=0.0753)。所以自由基清除率与预测值之间具有较好的拟合优度,可用于 Aspergillus固体发酵提取物抗氧化活性的分析和预测。从 3个因素对提取物抗氧化活性的影响来看,回归方程的一次项中B和 C对发酵提取物抗氧化活性的影响极显著(P＜0.01),且影响能力 B＞C,即液料比 ＞乙醇浓度,提取时间的线性影响不显著,各因素二次项 A2、B2和 C2的影响也达到了极显著水平,交互作用项中仅AC达到了显著(P＜0.05)的水平。这也表明了响应值的变化复杂,不仅受单因素的影响,而且还存在交互作用。

表 5 响应面试验设计方差分析表Table 5 Analysis of variance for the response surface design

*P＜0.05,**P＜0.01

继续对回归方程进行数学分析,可得到最大响应值所对应的提取条件,择优的提取条件为:时间120.40min,液料比 15.70mL/g,乙醇浓度 61.30%,理论提取物抗氧化活性为 82.52%。各因素取值与中心点取值接近,且理论值与中心点试验结果吻合,故无需做验证试验。而未发酵的对照提取物清除 DPPH自由基活性为 46.8%。

2.2 HPLC检测木脂素提取液

由图 1可知,经过发酵的提取液 HPLC色谱图中,在保持时间为 10.3 min时,发现一种含量有显著提高的特征物质 Px。

图1 芝麻饼粕木脂素提取物的 HPLC比较Fig.1 Comparison of sesame cake lignan extraction by HPLC

2.3 特征物质 Px分离纯化及鉴别

2.3.1 TLC检测结果

柱层析的特征物质 Px结晶经过展开剂展层,紫外扫描的结果如图 2所示,特征物质 Px峰型单一,无明显的杂质峰,所以柱层析达到了提纯的效果,获得了单一的纯化物。根据迁移的距离,计算出芝麻素的 Rf=0.425,特征物质 Px的 Rf=0.20。

2.3.2 质谱技术(LC-MS)

图 2 紫外扫描芝麻素和特征物质PxFig.2 The UV scanning spectrum of sesamin and Px

对分离纯化的特征物质进行 ESI/MS分析,质子化[M+H+]峰(m/z 370.0)产生的片段如图 3所示,其分子量为 370 Da,失去一个 H后,变为 369.0 Da,分子量为:Mr=370.0 Da。根据相关文献[10],确认产生的特征物质为芝麻素酚,分子组成为:C20H18O7,结构如图 4所示。

3 结论

3.1 通过正交优化试验得出,影响从酱油曲霉发酵芝麻饼粕中提取抗氧化物质的各因素的主次顺序为:A＞C＞B＞D,即乙醇浓度对提取率影响最大,其次为液料比和提取时间,最弱的为提取次数。

3.2 利用 Design expert设计软件,采用响应面分析法优化了从发酵的芝麻饼粕中提取木脂素的较优条件为:时间 120.4min,液料比 15.70mL/g,乙醇浓度 61.3%,在此条件下,发酵提取物的抗氧化活性可达 82.52%,未发酵的对照为 46.8%。

3.3 HPLC检测发酵的芝麻饼粕木脂素提取物中出现一种特征物质,利用硅胶柱层析技术分离纯化、薄层色谱检测和 LC-MS进行鉴别,确认该物质为芝麻素酚,分子量为:Mr=370.0 Da,分子组成为:C20H18O7。

通过对酱油曲霉发酵芝麻饼粕木脂素的提取和分析,发现一种含量显著提高的木脂素,据文献报道,其主要存在于芝麻油的加工和提炼过程中。该物质在体外和体内均有较强的抗氧化能力,并且具有特殊的生理功效,对其产生机理和生理活性,有待于进一步研究。

1 Tang CH(唐传核),Peng ZY(彭志英).Exp loitation and untilization of sesamin.China Cerolein(中国油脂),2000,25:62-63

2 Yung Shin Shyu,Lucy Sun Hwang.Antioxidative activity of the crude extract of lignan glycosides from unroasted Burma b lack sesame meal.Food Res International,2002,35:357-365.

3 Feng ZY(冯志勇),Gu KR(谷克仁).Composition,structure and physiological function of lignans in sesame seed.China Oil(中国油脂),2004,29(7):56-60.

4 Jin QZH(金青哲),Liu YF(刘元法),Wang XG(王兴国),etal.Study on the extraction and isolation sesamin from sesame cake.Machinary for Cearials Oil and Food Processing(粮油加工与食品机械),2005,(5):52-55.

5 Dong Y(董英),Gao Y(高音),Xu B(徐斌).Study on the extraction technology of lignans from sesame cake.Food Res Dev(食品研究与开发),2006,27(6):72-74.

6 FerrariKB.Functional foods and physical activities in health p romotion of aging peop le.Maturitas,2007,58:327-339.

7 Yamashita K,Ikeda S,Iizuka Y,et al.Effect of sesam inol on p lasma and tissueα-tocopherol andα-tocotrienol concentrations in rats fed a vitamin E concentrate rich in tocotrienols.Lipids,2002,37:351-358.

8 Dong Y(董英),Zheng W(郑伟).Study on the extract technology of sesame fermentation extraction.Food ResDev(食品研究与开发),2007,28:20-23.

9 Sanchez-Moreno C,Larrauri Jose A,Saura-Calixto,et al.A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols.J Food Sci Agric,1998,76:270-276.

10 Fukudaa Y,Nagatab M,Osawa T,et al.Contribution of licjnan analogues to antioxidative activity of refined unroasted sesame seed oil.JAOCS,1986,63:1027-1031.