牦牛血液铜锌超氧化物歧化酶cDNA克隆测序

陈增国，毛德才，毛 亮，海思源，徐亚欧

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.泸州医学院心肌电生理研究室，四川 泸州 646000）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）简称SOD。1938年，Mann和Keilin首次从牛红细胞中分离出一种含铜蛋白质（Hemocuprein），1953年又从小牛等动物肝中分离出肝铜蛋白。1968年，McCord和Fridovich等对Hemocuprein的功能进行研究，由于能催化超氧阴离子O2.-的歧化反应，因此将其命名为超氧化物歧化酶（SOD），超氧化物歧化酶的作用主要是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（Superoxide radical，O2.-）等中间物的毒性，能有效地防御活性氧对生物体的毒害作用。

按SOD中金属辅基的不同，可将其分为以下3类：第一类是Cu/Zn-SOD，主要存在于真核细胞的细胞质中；第二类为含有Fe、Mn或二者都有的Fe/Mn-SOD，Fe-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的基质中，Mn-SOD主要存在于原核细胞体、真核细胞的细胞浆和线粒体内；第三类是NiSOD，在土壤链霉菌和藻青菌中发现。

1991年侯金泉等研究表明，不同生物的SOD含量有很大差别，就是同种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD含量也各不相同。其中SOD含量最丰富的是动物肝脏组织，动物血液中也富含SOD。因此，在生产实际中动物Cu/Zn-SOD基本是从动物血液的红细胞中提取的。众所周知，成熟的红细胞内没有细胞核，那么红细胞中的Cu/Zn-SOD是在成熟红细胞中合成的，还是在其他细胞合成后转运到红细胞中的呢？为此，本试验选择牦牛血液作为研究对象，检测牦牛血液中是否存在合成Cu/Zn-SOD的mRNA。

1 材料与方法

1.1 材料 牦牛新鲜血液取自四川省阿坝州红原县的纯种牦牛，颈静脉采血10mL，置-20℃保存备用。

主要仪器及试剂：iCycler iQTM荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；凝胶成像系统Doc2000（Bio-Rad公司，美国）；Tgradient PCR 仪（Biometra公司，德国）。无水乙醇，琼脂糖等购自Promga公司；分子量标准物 DL2000，Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒，DEPC、PCR 产物纯化试剂盒，BL21（DE3）感受态细胞，pGM-T PCR产物克隆试剂盒均购自北京天为时代公司。

1.2 方法

1.2.1 牦牛血液总RNA提取 取牦牛新鲜血液300 μL，采用trizol法提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。

1.2.2 PCR引物设计与合成 根据奶牛Cu/Zn-SOD cDNA序列（序列号：NM 174615），用Primer 5软件设计一对PCR引物，上游引物序列为5′-GGCGTCGTTT TCTCTACTTGGT-3′、下游引物序列为 5′-GTGCCACA GAGAATGTTTAT-3′（Ysod1、Ysod2），由四川英骏生物公司合成。扩增片段大小为483bp。

1.2.3 cDNA第一条链合成和PCR扩增 以提取的总RNA样品为模板，Oligo-dT为引物，用AMV反转录酶合成cDNA第一条链。反应体系用Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒合成cDNA第一条链，其配置参考Takara RNA PCR试剂盒说明书。反应条件为45℃反应45min，99℃反应5min，4℃保存。

以合成的第一条cDNA链为模板，以Ysod1、Ysod2为引物进行PCR扩增。

PCR 反应体积 50μL，包括 2μLMgCl2，5μL 10×PCR Buffer，0.25 μL ExTaq，1 μL dNTP，0.5 μL Ysod1，0.5μL Ysod2，2μL RT产物，38.75μL去离子水。94℃预变性2 min，然后进入PCR循环，58.5℃退火30 s、72℃延伸1min，进行40个循环，4℃保存，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 RT-PCR产物克隆测序 按pBS-T PCR产物克隆试剂盒提供的方法将PCR产物与载体连接后转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞，逐一挑取单个白色菌落，接种于LB培养基中，振荡培养后取菌液进行PCR鉴定，所得条带与RT-PCR扩增条带大小相同。挑选经过PCR、凝胶电泳检测为阳性的菌液交由四川省成都市英骏生物公司测序。

2 结果及分析

2.1 牦牛血液总RNA提取 对从牦牛血液中提取的总RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。由图1可见，从牦牛血液中提取的总RNA电泳后可见一条较浅的28S的RNA谱带，这与本实验室毛德才从牦牛肝脏组织样品中提取的总RNA存在28S、18S、5S谱带有明显的不同（图2）。

2.2 牦牛Cu/Zn-SOD RT-PCR扩增产物电泳结果RT-PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，获得1条大小约为483bp的特异性条带，与预期目标片段大小基本一致，见图3。

图1 牦牛血液总RNA样品电泳图

图2 牦牛肝脏总RNA电泳结果

图3 RT-PCR产物凝胶电泳图

2.3 牦牛Cu/Zn-SOD T-A克隆鉴定 将RT-PCR扩增产物按少量DNA胶回收说明书进行回收后，取5 μL回收产物用1%琼脂糖凝胶电泳，出现一条较纯的目的片段，说明胶回收成功。胶回收产物与pGM-T载体连接后，转化到宿主菌TOP10并涂在含有Amp的LB固体平板上，37℃培养过夜，随机挑取白斑转到含100 mM Amp的LB液体培养基中摇转培养过夜，然后以菌液为模板进行PCR扩增反应鉴定重组结果。

2.4 重组子的PCR鉴定 挑选白色菌落，接种于LB液体培养基中进行培养，以菌液中的重组子为模板进行PCR扩增，产物经凝胶电泳后发现PCR扩增片段位于约483bp处，与RT-PCR产物电泳图一致，初步确定克隆成功（见图4）。

2.5 克隆产物测序 挑选经过PCR、凝胶电泳检测为阳性的菌液交由四川省成都市英骏生物公司测序，结果得出测序片段大小为483bp。经比较，与毛德才从牦牛肝脏组织中获得的cDNA序列完全一致。

图4 重组子PCR鉴定结果图

3 小结与讨论

通过对比牦牛血液总RNA样品电泳图和牦牛肝脏组织总RNA电泳图，发现牦牛血液样品总RNA样品电泳图可见一条较浅的28S RNA谱带，因此证实了牦牛血液中的RNA含量很低。

本试验选取高原畜种牦牛为研究对象，从牦牛血液中提取总RNA，反转录克隆了牦牛Cu/Zn-SOD cDNA，经测序，片段大小为483bp。证实该序列是牦牛SOD的cDNA序列。

由于成熟的红细胞中没有细胞核，因此并不具备合成SOD的条件，但是本试验却从牦牛血液中提取到了少量SOD的mRNA。那么，牦牛血液中合成SOD的mRNA就可能有几个来源：第一，可能是红细胞还没有成熟前就已经合成了SOD蛋白质；第二，可能是其他细胞合成后转运到红细胞中的。而红细胞中的具体来源还有待于进一步研究证实。

[1]Mannt，Keilin D. Hemocuprein and hepatocuprein copper-protein compounds of blood and liverin mammals[J].Proe R SoeB，1938，126：303-315.

[2]McCord J M，Frodovich I.Superoxide dismutase.An enzymic function for erythrocuprein （hemocuprein）[J].Biol.Chem.，1969，244：6049-6055.

[3]李文杰.超氧化物歧化酶在治疗超氧阴离子自由基所引起的疾病及抗衰老上的应用 [J].中国药学杂志，1989，24（7）：397-400.

[4]王庆莉，王居亮，陈德展.超氧化物歧化酶的理论研究进展[J].山东师范大学学报（自然科学版），2009，24（2）.

[5]侯金泉，等.十八种动植物SOD含量探讨[J].生化药物杂志，1991，（2）：25.