景宁木兰与木兰属其它植物之间亲缘关系与遗传基础研究

蒋燕锋，刘 饶，斯金平*

（1. 浙江林学院 林业与生物技术学院，浙江 临安 311300；2. 浙江省景宁县科技开发服务部，浙江 景宁 323500）

景宁木兰与木兰属其它植物之间亲缘关系与遗传基础研究

蒋燕锋1，刘 饶2，斯金平1*

（1. 浙江林学院 林业与生物技术学院，浙江 临安 311300；2. 浙江省景宁县科技开发服务部，浙江 景宁 323500）

采用ISSR（Inter simple sequence repeat）分子标记研究景宁木兰（Magnolia sinostellata）与17个木兰科木兰属其它植物之间的亲缘关系，揭示景宁木兰的遗传基础。在本试验条件下，从120个ISSR引物中筛选出20个具有多态性的引物，共检测到178条清晰的条带，其中163条具有多态性，占91.60%。通过POPGENE 32软件分析，除了木兰亚属的山玉兰独自成一类外，符合赫钦生的木兰属分类系统：厚朴、广玉兰及其变种为木兰亚属一类，其余包括景宁木兰、天目木兰、武当木兰等为玉兰亚属一类；玉兰与辛夷的杂交种二乔木兰与辛夷的遗传距离最近，为0.231 4，与玉兰的遗传距离也只有0.316 7；木兰属内遗传距离最近的为天目木兰与日本辛夷，为2.232 1，遗传距离最远的为山玉兰与日本辛夷，为0.736 9；景宁木兰与本属其它植物间的遗传距离在0.278 2 ～ 0.610 9，其中与天目木兰的遗传距离最近，为0.278 2，与山玉兰的遗传距离最远，为0.610 9。这表明景宁木兰具有其特有的遗传基础，且与天目木兰亲缘关系最近。

景宁木兰；ISSR；遗传关系

景宁木兰（Magnolia sinostellata）是1984年发现、1989年定名的木兰属新种[1～2]，原分布区十分狭窄，至今仅在浙江省景宁畲族自治县东坑镇大张坑村与景宁林业总场草鱼塘林场交界处（29.9° N、119.6° E）发现有自然分布，整个分布区约25 hm2，集中分布区仅0.2 hm2，种群数量少，刚发现时约有120株（丛），因该种具有较高的观赏价值，后因一些个体木兰园和养花爱好者盲目乱挖，现存野生植株约60株（丛），使该种刚刚发现就濒临灭绝。景宁木兰的资源现状及保护价值[3]在第一届国际木兰大会交流后引起有关专家的高度重视，被大会列为最有闪光点的报告之一[4]。浙江省也将该种列入珍稀濒危植物名录。本文采用ISSR[5]（Inter simple sequence repeat）分子标记技术研究景宁木兰与木兰属其它植物之间的亲缘关系，揭示景宁木兰的遗传基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为植物嫩芽。于杭州植物园采集17种木兰科木兰属植物以及浙江景宁林业总场草鱼塘林场的景宁木兰嫩叶（表1），用硅胶干燥，－70℃冰箱存放备用。

表1 实验材料Table 1 Test material

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）—硅珠吸附法提取植物基因组DNA[6]，用NanoDrop微量分光光度计（ND-1000）测定DNA的纯度和浓度。同时每个样品取5μL，加1μL上样缓冲液混合后，于0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测[6]，在凝胶成像系统（Gel DocTM，Bio-Rad）下观察并照相。

1.2.2 PCR扩增 扩增体系参考陈亮明等广玉兰ISSR-PCR反应体系[7]，20μL体系：50 ng DNA模板，0.5μmol/L ISSR引物，100.0μmol/L dNTPs，1.5 mmol/L氯化镁，1U Taq DNA聚合酶，10×PCR反应缓冲液。PCR反应程序：94℃预变性5.0min；94℃变性30 s，引物最适退火温度退火40 s；72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸5.0 min。PCR扩增产物于10.0 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测并于凝胶成像系统拍照分析。本实验在Perkin-Elmer 9700（PE9700）扩增仪上进行。

1.2.3 引物筛选 所用ISSR引物参考加拿大UBC大学提供的引物序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物先用一个模板DNA从100个ISSR引物中初筛。然后用4个模板DNA进行复筛，筛选出条带清晰而且具有多态性的引物，用于正式的PCR扩增[8]。

1.2.4 数据统计与分析 同一引物，同一位点，根据扩增产物的有（1）无（0）得到二元资料，形成0,1矩阵。用POPGENE32软件[9]进行分析，计算遗传相似系数，运用UPMGA法构建树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA结果检测与分析

获取高质量的基因组DNA是实验成功的关键步骤之一。本实验采用CTAB—硅珠法从植物嫩芽中提取模板DNA，经过琼脂糖凝胶电泳检测，发现条带十分清晰而且明亮无拖尾、背景干扰等现象，表明蛋白质等杂质去除较干净，纯度较高，经测定260/280比值在1.8左右，其浓度、纯度均符合实验要求。

2.2 ISSR引物筛选分析

随机用1个样品对120个引物进行筛选，结果有较多引物都有扩增，每个引物可扩增出1 ～ 15条带不等；再次对条带清晰、主带明显的初筛引物进行筛选，最终选用的20个引物（见表2）反应稳定、扩增性强和重复性好。

2.3 ISSR多态性分析

筛选出的20个引物共检测到178条带，平均每条引物扩增出8.9条带，ISSR扩增片段大约集中在300 ～ 1 500 bp。其中163条带表现为多态性，占总条带数的91.6%。扩增出条带最多的引物为809，共12条；条带最少的是引物807；多态性最高的是引物899，多态率高达100%（表2）。图1是引物810扩增的结果。

图1 引物810扩增结果Figure 1 Amplification result with primer of 810

表2 引物序列及其扩增结果Table 2 Primer sequence and amplification result

2.4 遗传距离聚类分析

利用聚类分析软件 POPGENE 32对ISSR-PCR扩增所得的多态性位点进行分析，计算得到17个样品的Nei’s遗传距离[10]及遗传相似矩阵（图2）。从聚类结果可以看出，17个样本在系数为0.6左右明显可分为3类：第一类仅有山玉兰；第二类由厚朴及其变种凹叶厚朴和广玉兰及其变种狭叶荷花玉兰组成；第三类则包含景宁木兰、天目木兰、日本辛夷、宝华玉兰及其余的木兰科植物。

图2 木兰科植物遗传聚类图Figure 2 Dedrogram of 17 species of Magnolia

与形态学分类对比分析，除了木兰亚属的山玉兰独自成一类外，符合赫钦生的木兰属分类系统：厚朴、广玉兰及其变种为木兰亚属一类，其余包括景宁木兰、天目木兰、武当木兰等为玉兰亚属一类；玉兰与辛夷的杂交种二乔木兰与辛夷的遗传距离最近，为0.231 4，与玉兰的遗传距离也只有0.316 7。木兰属内遗传距离最近的为天目木兰与日本辛夷，为0.232 1，遗传距离最远的为山玉兰与日本辛夷，为0.736 9。景宁木兰与本属其它植物间的遗传距离在0.278 2 ～ 0.610 9，其中与天目木兰的遗传距离最近，为0.278 2，与山玉兰的遗传距离最远，为0.610 9。表明景宁木兰具有其特有的遗传基础，且与天目木兰亲缘关系最近。

3 讨论

景宁木兰喜温暖湿润、水分充足的环境，其树形呈灌木状，丛生，叶片较小，特别是花被轮多数、花被片数量多，颜色紫红色至淡红色，且株间存在较大差异，花被片倒披针形或倒卵状匙形，不仅具有直接园艺开发的价值，而且具有木兰科植物间杂交、景宁木兰自身诱变育种等诸多方面的价值。

分子标记技术用于种质鉴定具有不受栽培环境影响的优势，对珍贵濒危的景宁木兰的遗传结构和遗传地位的研究具有非常重要的意义。

本研究运用ISSR分子标记技术对景宁木兰与其它17种木兰属植物的遗传结构研究表明，木兰属内各植物之间具有较大的遗传差异，遗传基础较宽。厚朴及其变种凹叶厚朴和广玉兰及其变种狭叶荷花玉兰之间遗传距离较近；二乔木兰、辛夷（紫玉兰）和玉兰三者间的遗传距离也比较近，这与其形态特征的相似相对应，特别是二乔木兰，是辛夷与玉兰的杂交种。相比之下，景宁木兰与山玉兰的遗传距离最远，亲缘关系较远，而与天目木兰的遗传距离最近，亲缘关系也最近。

[1] 裘宝林，陈征海. 浙江木兰属新种[J]. 植物分类学报，1989，27（1）：79－80.

[2] 斯金平，蔡通爱. 珍稀濒危植物景宁木兰[J]. 浙江林业科技，1998，18（1）：68－71.

[3] SI Jin-ping. Protection and Development of Magnolia sinostellata[A]. Proceedings of the International Symposium on the Family Magnoliaceae[C]. Beijing：Science Press，2000. 272－273.

[4] Richard B Figlar. South China: Its Magnolias and the 1998 Intermational Symposium on the Family Magnoliaceae[J]. MAGNOLIA, 1999（66）：1－17.

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[6] Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989. [7] 陈亮明，相阳，张冬林，等. 两种方法对广玉兰ISSR-PCR反应体系的优化比较[J]. 种子，2008，27（6）：10－14.

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[10] Nei M，Li W H. Mathematical models for studding genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc Nat Acad Sci USA，1979（76）：5 269－5 273.

Study on Genetic Relation among Magnolia sinostellata and Other Species of Magnolia

JIANG Yan-feng1，LIU Rao2，SI Jin-ping1
（1. School of Forestry and Biological Technology, Zhejiang Forestry University, Lin’an 311300, China; 2. Jingning Science and Technology Extension Station of Zhejiang, Jingning 323500, China）

Study was conducted on genetic relation among Magnolia sinostellata and other 16 species of Magnolia by inter simple sequence repeat (ISSR). 20 polymorphism primers were selected from 120 primers, and 193 bands were detected, of which 160 polymorphism. POPGENE 32 was used to calculate the genetic distance among these plants. Result showed that the polymorphism ratio was 82.90%, and the distance between M. sinostellata and other Magnolia ranged from 0.278 2 ( M. amoena) to 0.610 9(M. delavayi).Unweighted pair-group mean analysis (UPGMA) grouped them into three clusters: M. amoerna; M. officinalis, M. grandiflora and their varieties; M. sinostellata, M. amoena, M. sprengeri and so on. The results suggested that M. sinostellata had close genetic relation with M. amoena, M. kobus and M. zenii.

Magnolia sinostellata; ISSR; genetic relation

S718.3

1001-3776（2010）02-0022-04

2009-11-20；

2010-02-08

浙江省重大科技计划项目（2005C32052）

蒋燕锋（1984－），男，浙江嘉兴人，硕士研究生，从事药用植物遗传研究；*通讯作者。