1-磷酸鞘氨醇预处理对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞磷酸化Akt1水平的影响

袁磊 韩坤(漯河医学高等专科学校,河南 漯河 462002)

1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)是近年来发现的具有重要生理功能的一种膜磷脂类代谢产物。研究证实,S1P可通过相应受体激活PI3K-Akt信号通路,进而减轻缺血再灌注损伤[1,2]。Akt是S1P发挥心肌保护作用的关键分子。本研究通过建立缺氧/复氧乳鼠心肌细胞损伤模型,观察1-磷酸鞘氨醇(Sphingo-sine-1-phosphate,S1P)预处理对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞磷酸化Akt1水平的影响,探究S1P是否还通过激活Akt1进而减轻心肌细胞缺氧复氧损伤,保护心肌细胞。

1 材料与方法

1.1 动物

出生72h内的大鼠乳鼠,雌雄均可,状态良好,购于郑州大学医学院动物实验中心,动物合格证号：医动字010346号。

1.2 药品

DMEM高糖培养(长春博德生物公司);新生小牛血清(武汉三利生物);胰蛋白酶(美国Amresco);1-磷酸鞘氨醇(S1P)、渥曼青霉素(Wortmannin)、兔抗鼠磷酸化 Akt1抗体(Thr473)和辣根酶标记山羊抗兔IgG(Sigma)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠乳鼠心肌细胞原代培养

将出生72h内的大鼠乳鼠心室肌剪碎,用0.125%胰蛋白酶进行消化,利用差速贴壁法纯化心肌细胞,加入20%DM EM培养基,送37℃、95%O2+5%CO2的二氧化碳孵育箱中培养,每隔24h更换一次细胞培养液,待单层心肌细胞覆盖瓶底达80%以上时进行实验。

1.3.2 制备缺氧/复氧心肌细胞损伤模型

待心肌细胞生长至汇合状态时(72h),更换细胞培养液培养12h,使细胞同步化;然后置于92%N2及5%CO2孵箱中缺氧6h再恢复正常条件培养4h,造成缺氧/复氧损伤所致细胞凋亡模型。

1.3.3 实验分组及给药

实验分成三组：正常对照组(Control group),缺氧/复氧组(H/R group),S1P预处理缺氧/复氧组(S1P+H/R group),自模型制作前2d开始,每天实施S1P预处理2h,S1P终浓度为2.0μ mol◦L-1。

1.3.4 台盼兰排斥法检测细胞死亡率

将细胞悬液和0.4%台盼蓝染液按1：1体积比混合后加盖玻片,1min后计数100个细胞,活细胞透明,死细胞染成蓝色,着色细胞数计为N,用死细胞占计数细胞中的百分比表示细胞死亡率,即(N/100)×100%。

1.3.5 心肌细胞内磷酸化Akt1含量检测

采用Western Blot方法。提取各实验组细胞内总蛋白,进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,按目的蛋白的位置来切胶;将目的蛋白从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜上,封闭PVDF膜;依次加入一抗(兔抗鼠磷酸化 Akt抗体)和二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG),以上步骤之间均充分孵育和洗涤;然后将PVDF膜放入显色液进行显色,并拍照保存;用图像分析软件检测蛋白区积分光密度值(Iintegrated optical density,IOD),用蛋白区IOD值表示各组蛋白表达量,以p-Akt1与Tublin的积分光密度比值(R值)作为p-Akt1的相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 S1P预处理对缺氧/复氧心肌细胞死亡率的影响

H/R组较Control组细胞死亡率显著升高(P＜0.001);S1P+H/R组细胞较H/R组死亡率显著降低(P＜0.002),这表明S1P预处理能够明显减轻缺氧/复氧损伤保护心肌作用。结果见表1。

表1 各实验组细胞死亡率(,n=3)

表1 各实验组细胞死亡率(,n=3)

注：与对照组相比,＊P＜0.005,＊＊P＜0.001;与缺氧复氧组相比,#P＜0.002

组别 细胞死亡率(%)对照组 1.52±2.13缺氧复氧组 47.14±2.66＊＊S1P预处理+缺氧复氧组 21.42±2.72＊#

2.2 Tublin(微管蛋白)和磷酸化Akt1的蛋白质印迹

内参蛋白Tublin的分子量为51kd,磷酸化Akt1(p-Akt1)是分子量为60kd的蛋白质分子。Tublin和p-Akt1的western blot结果如图1。

图1 WesternBlot测定 Tublin和 p-Akt1的蛋白表达情况

2.3 分析蛋白条带的积分光密度值和R值

以p-Akt1与Tublin的IOD比值(R值)作为 p-Akt1的相对表达量(表2)。结果显示,Control组R值最低,这表明在正常心肌细胞内仅有少量Akt1被活化;H/R组R值较Control组轻度升高(P＜0.05),这表明缺氧复氧刺激能够轻度激活Akt1;S1P+H/R组R值较 H/R组显著升高(P＜0.01),说明S1P预处理能够显著提高Akt1的磷酸化水平。

表2 Tublin和p-Akt蛋白条带的积分光密度值和R值(,n=3)

表2 Tublin和p-Akt蛋白条带的积分光密度值和R值(,n=3)

注 ：与对照组相比,＊P＜0.05,＊＊P＜0.001;与缺氧复氧组相比,#P＜0.001

组别 IOD Tublin p-Akt1R对照组 170.33±2.58 31.326±0.736 0.1838±0.0031缺氧复氧组 171.11±2.16 33.494±0.919 0.1957±0.0033＊S1P预处理 +缺氧复氧组 169.23±2.37 116.90±1.47 0.6908±0.0018＊＊##

3 讨论

1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)是近年来发现的具有重要生理功能的一种膜磷脂类代谢产物。它既可作为一种细胞内第二信使,又可作用于细胞膜表面特定的受体而发挥其重要的生物学功能。S1P与细胞的多种生命活动密切相关,包括细胞的增殖、分化、凋亡和迁移等。

近年研究发现细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤过程中心肌细胞死亡的重要机制之一,而PI3K-Akt信号通路正是近年来备受关注的凋亡抑制通路之一。研究证实,S1P可通过与S1P2受体和S1P3受体结合,激活 PI3K-Akt信号通路,使细胞内磷酸化Akt水平升高,进而减轻缺血再灌注损伤,抑制心肌细胞凋亡,发挥心肌保护作用[1,2]。Akt的下游信号包括：Bad、caspase-9 、GSK3 、FH 转录因子、Iκ B 激酶。 目前对 Akt的抗凋亡机制更倾向于其维持线粒体膜的完整性,Akt可使Bcl-2家族成员Bad的Ser136磷酸化而促使它和14-3-3蛋白结合,Bcl-2或Bcl-xL得以脱离Bad的抑制,调节线粒体通透性,阻止细胞色素C(CytC)和凋亡诱导因子(AIF)的释放,发挥抗凋亡作用,这可能是Akt促进细胞存活的重要机制之一[3]。

本研究以缺氧/复氧心肌细胞损伤模型为研究对象,采用Western Blot方法,通过检测心肌细胞内磷酸化Akt1水平,旨在探究S1P是否能通过非PI3K依赖的信号通路激活Akt1。实验结果显示,H/R组R值较Control组轻度升高(P＜0.05),这表明缺氧复氧刺激能够轻度激活Akt1,但意义不大;H/R+S1P组磷酸化Akt1水平在各实验组中最高(P＜0.001),这表明S1P能够显著提高缺氧复氧心肌细胞内Akt1的磷酸化水平;当加入PI3K抑制剂Wortmannin后,PI3K受到抑制,Akt1是PI3K的下游分子,则Akt1的激活也被Wortmannin抑制,心肌细胞内磷酸化Akt1含量较H/R+S1P组明显下降(P＜0.001),但H/R+S1P+W组心肌细胞内磷酸化Akt1水平仍较H/R组高(P＜0.001),这说明Wortmannin仅能部分阻断S1P对Akt1的活化。

综上所诉,S1P对Akt1的激活还存在着非PI3K依赖的信号通路,这也将为进一步探索S1P诱导的心肌保护作用机制提供了新思路。

1 Means CK,Xiao CY,Li ZJ,et al.Sphingosine-1-phosphate S1P(2)and S1P(3)receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,292(6)：H2944-H2951.

2 Del Re DP,Miyamoto S,Brown JH.Focal Adhesion Kinase as aR-hoA-activable Signaling Scaffold Mediating Akt Activation and Cardiomyocyte Protection[J].J Biol Chem,2008,283(51)：35622-35629.

3 Downward J.How BAD phosphorylation is good for survival[J].Nat Cell Biol,1999,1(2)：E33-E35.