子宫内膜癌 CpG岛甲基化谱状态及其意义

张庆英 周 莉 张东红 易德青 周太梅

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖道常见的恶性肿瘤之一,全球每年约有 14.2万例妇女患病,其中 4.2万人死于该疾病[1]。随着生活方式的变化,EC在我国妇女中的发病率呈逐年上升趋势[2]。近年来的研究表明,EC的发生与抑癌基因失活有关,而基因异常甲基化是抑癌基因失活的 1种重要机制。DNA相关区域的每个 CpG位点有特异性的甲基化修饰,导致复杂的信息类型,形成特异性 CpG甲基化谱 (CIMP)。多基因甲基化研究可为不同类型肿瘤和同一肿瘤不同阶段提供丰富的表观遗传信息。本研究拟采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylated specific PCR,MSP)技术,检测 EC癌组织和癌旁配对组织以及正常子宫内膜组织中 5种肿瘤相关基因P14、P16、ER、RASSF1A、COX-2的甲基化及 CIMP状态,并分析其潜在的意义,以期进一步阐述 EC的表观遗传分子机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源

35例 EC组织标本及 15例相应的癌旁组织,来自汕头大学医学院附属肿瘤医院 2006年 1月至 2007年6月间手术切除标本,新鲜组织标本迅速保存于 -70℃冰箱。患者年龄为 46～67岁(平均年龄 53.3岁),所有患者术前均未接受放疗、化疗或激素治疗,肿瘤病理组织学分类按 WHO统一标准,病理分级和临床分期按 FIGO统一标准经该院病理科核实。另收集年龄 44～64岁、平均年龄 51.5岁的妇女炎性息肉、增生子宫内膜及正常内膜组织共 22例,作为正常对照。

1.2 研究方法

1.2.1 子宫内膜癌、癌旁及正常组织 DNA的提取上述组织 DNA提取严格按照安徽优晶生物工程有限公司的组织 DNA提取试剂盒 (JYZ-2-1-3)说明书操作,提取后的组织 DNA放于 -20°C冰箱保存。

1.2.2 DNA亚硫酸盐修饰及 MSP 取 10μg基因组DNA,补加 TE至 30μl,加入 3.3μl 3mol/L的 NaOH(溶液终浓度为 0.3 mol/L),吸头上下混匀后,37℃孵育 15min。配制 2.4 mol/L亚硫酸钠溶液,取 333μl到 DNA溶解液中,用吸头充分混匀,避光 55℃孵育4 h。用 DNA纯化柱(promage,A 7280)纯化除盐。操作严格按说明书进行,纯化后的 DNA于 -80℃保存于25μl TE中备用。检测 5种基因甲基化所用的引物序列参照文献设计[3],具体序列及扩增片段长度(由上海申能博彩公司合成)见表 1。

表1 MSP甲基化分析引物与非甲基化引物序列表

PCR反应混合物体系 25μl,包括 10×PCR Buffer 2.5μl,25mmol/L dNTP 2.5μl,10 mmol/L上下游引物 P1/P2各 1μl,修饰过的 DNA 2μl,2.5U Taq酶 1 μl,去离子水 15μl。以正常子宫内膜组织 DNA为对照,以去离子水代替模板 DNA作为空白对照。扩增条件为 95℃预变性 10 min,94℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,40个循环,72℃延伸 10m in,4℃保存。将 8μl扩增产物进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳(100 V,20 min),紫外成像分析仪下观察扩增结果。

1.2.3 CIMP的定义 参照文献[4],选择子宫内膜癌组织甲基化基因平均数作为基准,大于此均数者为 CIMP+,本研究检测的 5种基因中,如果出现 3个或以上基因同时甲基化则为 CIMP+;2个或 2个以下基因同时甲基化则为 CIMP-。

统计学处理:数据采用 SPSS 13.0软件进行统计分析,计数资料比较采用 χ2检验和 Fisher精确概率计算法,P≤0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜癌、癌旁及正常子宫内膜组织中基因启动子区甲基化修饰状况

采用 MSP方法,检测 35例癌组织,15例癌旁组织及 22例正常组织中 5种肿瘤相关基因(P14、P16、ER、RASSF1A、COX-2)启动子区甲基化修饰状况。根据MSP电泳结果 (图 1)分为三类甲基化结果:①高甲基化修饰:只有甲基化特异性扩增产物,提示启动子区有甲基化修饰;②只有未甲基化特异性扩增产物,提示启动子区没有甲基化修饰;③当甲基化和未甲基化特异性扩增产物均有时,提示启动子区为部分甲基化修饰。

图1 MSP法检测 5种基因甲基化电泳图

本组结果显示,5种基因在 EC组织中的启动子区甲基化频率从 P16的 37%至 P14的 57%不等,在癌旁配对组织中则从 P16的 27%至 P14的 60%不等。正常子宫内膜组织中仅有 2例表现为 ER和 COX-2甲基化,4例RASSF1A甲基化,P14和P16没有甲基化。其中 5种基因的甲基化频率 EC组织中与癌旁组织分别为P16(37%vs.27%),COX-2(54%vs.47%),RASSF1A(57%vs.40%),P14(57%vs.60%),ER(52%vs.53%),两组分别比较,差别均无统计学意义(P＞0.05),见表 2。然而,EC组织与癌旁组织中 5种基因甲基化频率均高于正常组织(P＜0.01)。

2.2 EC、癌旁组织和正常组织中 CIMP频率

进一步分析 5种基因在上述组织中的甲基化修饰状况,发现 97%(34/35)的 EC组织中至少有 1个或1个以上基因启动子存在甲基化修饰,只有 1例 EC组织没有检测到甲基化修饰。35例 EC组织中,6例(17%,6/35)有 1个基因甲基化,11例 (31%,11/35)有 2个基因甲基化,7例 (20%,7/35)有 3个基因甲基化,9例 (26%,9/35)有 4个基因甲基化,1例(3%,1/35)有 5个基因甲基化。平均每例 EC组织中有(2.57±1.22)个(中位数为 2.0)甲基化基因。在 15例癌旁组织中,1例 (6%,1/15)没有基因甲基化,4例 (27%,4/15)有 1个基因甲基化,3例 (20%,3/15)有 2个基因甲基化,4例 (27%,4/15)有 3个基因甲基化,3例 (20%,3/15)有 4个基因甲基化,平均每例癌旁组织中有(2.27±1.28)个(中位数为 2.0)甲基化基因。而 22例正常子宫内膜组织中,只有 6例出现 1个基因甲基化,其他 18例没有检测到基因甲基化。

在 35例 EC组织、15例癌旁组织和 22例正常子宫内膜组织中,46%(17/35)的 EC组织为 CIMP+,54%(18/35)EC组织为 CIMP-;47%(7/15)癌旁组织为 CIMP+,53%(8/15)癌旁组织为 CIMP-;而在正常组织中则没有 CIMP+。CIMP在 EC组织与癌旁组织中差异没有统计学意义(P=0.574)。

2.3 CIMP状态与肿瘤相关基因甲基化的关系

17例 CIMP+的肿瘤组织中,甲基化频率最高的基因为 COX-2(88%),其余分别为 P14(71%)、P16(71%)、RASSF1A(71%)和 ER(65%)。CIMP+与P16(γ=0.673)和 COX-2(γ=0.662)的甲基化密切相关(P＜0.001),见表 3。

表2 子宫内膜癌及其癌旁组织中 5种基因甲基化频率情况(例,%)

表3 子宫内膜癌中 CIMP状态与 5种基因甲基化的关系(例,%)

3 讨论

肿瘤的发生是多病因、多步骤的过程,其中包括原癌基因的活化,抑癌基因的失活,细胞循环调控基因、肿瘤侵袭相关基因以及错配修复基因的功能紊乱等。但是这些异常基因导致正常细胞转变为癌细胞的具体机制仍不清楚。DNA甲基化尤其是基因启动子区 CpG岛的高甲基化,会导致基因表达的下降或沉默。甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面,一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合;另一方面可能与一些甲基化相关蛋白的作用有关,甲基化 CpG结合蛋白可以占据转录因子的结合位点,从而抑制基因的表达。

许多研究表明,子宫内膜癌中存在多种肿瘤相关基因启动子区 DNA甲基化现象,包括细胞周期调控、血管形成、凋亡等基因启动子甲基化的紊乱,直接影响细胞周期和信号传导途径,细胞生长、分化、增殖、凋亡等相继异常,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[5～7]。雌孕激素受体(ER,PR)甲基化与子宫内膜癌 Ras相关结构域家族 1A基因(RASSF1A)启动子区域在妇科恶性肿瘤细胞中的甲基化状态与 p16基因转录抑制高度相关[6,7]。P16-cyclinD-cDK4-RB是 1个重要的基因网络,在细胞调控中起着异常关键的作用,这个网络体系涉及的很多基因在子宫内膜癌都存在异常现象,因此可能是其发生的 1个重要基因变异机制,P16甲基化可能是 1个始发事件导致细胞周期调控基因失活[8]。COX-2及其主要的酶代谢物前列腺素 E2,与肿瘤的发生发展有关,并可能是预测早期宫颈癌的 1个标志物[9,10]。目前对于上述这些子宫内膜癌相关基因的研究多限于单个基因的甲基化修饰,对于多基因的在组织中的甲基化状态研究却较少。但已有的研究提示多个相关基因特异性位点甲基化,在不同的组织和同一组织不同阶段,形成特异性的甲基化谱,与肿瘤的早期诊断、临床病理特征及预后相关[11,12]。

我们的检测结果表明,子宫内膜癌组织中 5种基因的甲基化频率从 10%(P16)至 94%(P14)不等,97%肿瘤组织中至少有 1个基因发生甲基化。P14、P16、ER、RASSF1A、COX2在 EC组织中同时甲基化现象频繁发生,这些结果提示多基因同时甲基化在 EC癌变中有重要作用。同时,异常的 CIMP+主要在子宫内膜癌及相邻癌旁组织中而不是正常的内膜组织中,说明多基因甲基化在癌前病变或患者组织学正常的组织中存在,可能是癌变的早期事件。此外,P16和 COX-2的甲基化与 CIMP+状态相关。周莉等实验曾报道发生 P16甲基化的子宫内膜癌组织大多属癌变早期,未发生淋巴结转移及浸润程度较低,且甲基化与肿瘤晚期的标志物 CA125水平呈负相关[13]。相反的是,肝细胞癌中 P15和 P16甲基化与血清中的甲胎蛋白水平呈正相关[14]。这些证据也支持 CIMP+可能是子宫内膜癌癌变的早期事件这一观点,但仍需要进一步的实验验证。

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