结直肠癌术后放化疗联合 DC-CIK的疗效分析

应敏刚 魏植强 杨建伟 陈路川 郑秋红

我院从 2000年 12月至今在结直肠癌根治术后放化疗的基础上,加以热休克蛋白负载的树突细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)疗法,明显降低了复发率,提高了远期生存率,现总结报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

所选病例为 2000年 12月至 2006年 10月的住院患者共 102例,均经病理学、组织学、细胞学等检查确诊为结直肠癌,均行结直肠癌根治术,术后病理检查证实为 R0切除。102例患者均为 AJCC(1997)TMN分期的Ⅰ ～Ⅲ期患者,对 I期患者,术后不行放化疗。Ⅱ～Ⅲ期患者术后辅助化疗。DC-CIK治疗组 51例,男性 31例,女性 20例,年龄 28～86岁,中位年龄 59岁,Ⅰ期 6例,ⅡA期 3例,Ⅱ B期 12例,Ⅲ期 30例,术后辅助化疗采用 FOLFOX方案 33例,采用 XELOX方案7例,采用 CF+5-Fu方案 3例,采用希罗达方案 2例。接受术后辅助放疗 7例。对照组 51例,男性 25例,女性 26例,年龄 20～78岁,中位年龄 54岁,其中Ⅰ期 6例,ⅡA期 3例,Ⅱ B期 12例,Ⅲ期 30例,术后采用FOLFOX方案化疗 35例,采用 XELOX方案 3例,采用CF+5-Fu方案 5例,采用希罗达方案 2例,接受术后辅助放疗 9例。两组患者卡氏评分均≥80分,肝、肾功能正常,外周血 WBC≥4.0×109/L,PLT≥100×109/L,H b≥80 g/L,无严重的内科疾病。

1.2 主要试剂

Ficoll淋巴分离液(北京军事医学科学院 );rh IL-4(英国 Pepro Tech公司);TNF-α(上海赛达生物药业有限公司);CD3McAb(武汉生物制品研究所);IFN-r(上海克隆公司);rh IL-2(北京瑞德合通药业有限公司 );GM-CSF(北京联合药业有限公司 );RPMI1640、无血清培养基 AIM-V(美国 Gibco公司)。

1.3 HSP70多肽复合物的制备

来源于患者自身肿瘤组织或肿瘤细胞系经玻璃匀浆或超声波粉碎后,21 000 g/min,离心 60 min,取上清,参照文献[1]方法,分离纯化 HSP70多肽复合物作为肿瘤抗原,用于负载 DC。

1.4 方法

参照文献[2,3]方法新鲜分离的患者抗凝外周全血50ml,经淋巴分离液梯度离心,取界面层单个核细胞,用 RPMI1640培养液悬浮细胞,离心洗涤细胞 3次后,收集非贴壁细胞,调整细胞密度约为 1×106个/ml,加入 γ-干扰素 1 000 U/ml,24 h后加入 rhIL-2 300U/ml,CD3McAb 70 ng/ml,IL-110U/ml,每 3天换液 1次,同时补加 rhIL-2 100 U/ml。在上述获得的贴壁细胞中加入含 GM-CSF 1 000U/m l和 rh IL-41 000U/ml的 AIMV培养基,每 3天换液 1次。第 3天将按 5 ng/ml将HSP70多肽复合物加入 DC培养液内,第 5天加入TNF-α1 000 U/ml,第 7天将负载后的 DC按 1∶5的比例加入 CIK培养液中,共培养 5～7天。培养 10天后制成细胞悬液用输血器回输,隔天回输 1次,将 DC、CIK 2种细胞体外混合后全身输注。剂量:DC-CIK回输 100m l/瓶,细胞数≥108个/m l,连续 8次为 1个疗程。治疗组患者最少行 1个疗程的 DC-CIK治疗,最多行 6个疗程的 DC-CIK治疗,平均行 4个疗程的DCCIK治疗,给药时间一般在术后或化疗结束后 15天开始。

1.5 化疗及放疗方案

所有Ⅱ～Ⅲ期患者行术后辅助化疗,采用 FOLFOX、XELOX、CF+5Fu或希罗达方案化疗 4～10个周期。术后对Ⅱ～Ⅲ期部分直肠癌患者辅助放疗,术后4～6个周开始放疗,照射剂量为每周第 1～5天,每天2 Gy,共 5周,总照射剂量为 50Gy。结肠癌患者未辅助放疗。

1.6 疗效评价

以复发时间和生存期作为观察指标,观察时间为患者手术时间到 2009年 10月 1日。

1.7 统计学方法

采用 SPSS15.0软件包进行生存率、无病生存率计算。应用 Kaplan-Meier生存曲线和 Logrank test检验比较两组生存率及无病生存率。率检验采用 χ2检验,以 P＜0.05表示统计学差异显著。

2 结果

2.1 DC-CIK治疗组与对照组临床资料对比结果

两组从性别、年龄、病理分期、AJCC(1997)中临床分期、术后辅助化疗方案、肿瘤部位和是否接受术后辅助放疗等方面进行比较,经卡方检验,结果显示两组资料无统计学差异,具有可比性(P＞0.05)(表 1)。

表1 两组患者的临床资料比较

2.2 生存率

全部病例随访至 2009年 10月,随访时间为 13～62个月,无失访,随访率为 100.0%。DC-CIK治疗组1、2、3年生存率分别为 100.0%、92.2%、88.2%,对照组 1、2、3年生存率分别为 100.0%、86.3%和 68.6%。DC-CIK治疗组和对照组中位生存期(mOS)分别为 63个月(95%CI,55-72)、52个月(95%CI,42-62)。 Kaplan-Meier生存曲线和 Logrank test检验结果表明,治疗组生存期明显长于对照组(P＜0.05),见图 1。

图1 两组总生存率比较

2.3 无病生存率分析

全部病例随访至 2009年 10月,随访时间为 1～62个月,无失访,随访率为 100.0%。DC-CIK治疗组 1、2、3年无病生存率(DFS)分别为 80.4%、54.9%、43.1%,对照组 1、2、3年无病生存率(DFS)分别为54.9%、33.3%和 27.5%。治疗组和对照组中位无病生存时间(mDFS)分别为 34个月(95%CI,28-40)、25个月 (95%CI,19-31)。Kap lan-Meier生存曲线和Logrank test检验结果表明治疗组无病生存率明显高于对照组(P＜0.05),见图 2。

图2 两组无病生存率比较

3 讨论

DC-CIK细胞具有增殖快、杀伤活性强等优点,在结直肠癌的治疗中具有广阔应用前景。细胞因子诱导的杀伤细胞 CIK细胞(cytokine-induced killer cells)是1种新型免疫活性细胞,兼有 T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤(natural killer cell,NK)细胞的非主要组织相关性复合物限制性杀瘤的特点,杀伤活性可达 84.7%。树突细胞(dendritic cell,DC)是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞,可有效激发 T细胞应答,有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。但肿瘤抗原肽的分子量均较小,难以直接被 DC所摄取;即使被DC摄取,亦不能有效的促进 DC成熟并表达各种黏附分子,缺乏激活 T细胞的第二信号,难以形成有效的免疫应答[4]。HSP的中文全称是 “热休克蛋白”,可与小分子肿瘤抗原肽结合,增强其免疫原性。肿瘤细胞中 HSPs结合有大量肿瘤细胞特异性抗原,因其携带几乎所有肿瘤抗原,故从肿瘤细胞中获取 HSP70多肽复合物,既可得到该肿瘤细胞高效、强免疫原性的肿瘤抗原,同时,由于 HSPs为高度保守蛋白质,同种内不具多态性,可实现对同一肿瘤内的所有瘤细胞特异杀伤,克服了肿瘤免疫治疗中难解决的抗原多变性及细胞异质性的问题。DC与经纯化的肿瘤 HSP70多肽复合物结合负载后,可活化机体特异性免疫和非特异性免疫反应,诱导机体产生长寿(long-lasting)的抗肿瘤免疫效应。张嵩等[5]以白血病细胞系 NB4建立裸鼠模型,结果发现在培养的 15 d,DC-CIK细胞较 CIK细胞增殖率明显提高,并可明显抑制肿瘤的成瘤率,予BAUl/c裸鼠经尾静脉注射 LoVo结肠癌细胞建立转移性肺癌模型.并以 DC-CIK细胞进行免疫治疗,结果发现 DC-CIK细胞较 CIK细胞有更强的杀瘤活性.可有效抑制血源性肿瘤转移,延长荷瘤鼠的生存时间。张京雨等[6]报道化疗联合 CIK细胞回输的结直肠癌患者 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK均显著高于化疗前组,且 CD8+显著低于对照组,说明化疗后及时应用CIK细胞回输可显著改善结直肠癌的免疫功能,有助于提高机体的抗肿瘤免疫效应。

本研究采用了 HPS70负载的 DC-CIK,明显提高了肿瘤特异性细胞毒性 T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),诱导高效的抗肿瘤免疫效应,结果显示DC-CIK治疗组 3年生存率及 3年无病生存率明显高于对照组,因此结直肠根治术后放化疗联合应用HPS70负载的 DC-CIK是安全有效的,结直肠癌根治术后放化疗联合 DC-CIK细胞疗法能明显减低复发率,并很有可能对提高结直肠癌患者的远期生存率有帮助。

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[2] 郑秋红,郑天荣,谢云青,等.树突状细胞对自体 CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2005,12(16):1237.

[3] 郑秋红,郑天荣,卢 林,等.人外周血树突细胞的分离与提纯〔J〕.福建医科大学学报,2000,34(2):115.

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[6] 张京雨,张晓明.CIK细胞过继性免疫治疗对结直肠癌化疗患者免疫指标的影响 〔J〕.肿瘤学基础与临床,2009,22(1):51.