纳豆菌的发酵条件优化及纳豆制备方法改良

2010-05-01周志江肖华志王占忠

山西农业科学 2010年9期

韩烨，周志江，肖华志，王占忠

（天津大学农业与生物工程学院食品科学系，天津300072）

纳豆是利用纳豆菌对大豆原料进行发酵而成，营养丰富，易于消化，并具有特殊的生理功效，如抗癌、抗氧化性、溶血栓性、降血压等，在亚洲具有悠久的历史[1-2]。纳豆菌为革兰氏阳性菌，属细菌科芽孢杆菌属，好氧型，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种[3]。

纳豆究竟是起源于朝鲜半岛还是日本不得而知，但其都是煮熟的大豆用稻草包好，利用稻草里的纳豆菌在温暖的环境下短期发酵而得到。如今，日本人已研究出纳豆对身体健康的效用，把纳豆发展为商业化产品，在最适温度下，直接利用纯种纳豆菌接种，进行大批量生产。而朝鲜半岛以及我国东北朝鲜族的人们还是利用传统的方法制作纳豆，只在于家庭食用。本研究对已分离到的纳豆菌Y-07进行了发酵条件的优化，旨在为改良民间制作纳豆的方法打下基础。

1 材料和方法

1.1 菌种

菌种Y-07为天津大学食品生物技术实验室从吉林省朝鲜族自治区民间纳豆制品中分离、筛选和保存的菌株，经传统的生理生化特性和分子生物学鉴定[4]，确定为纳豆菌（Bacillus subtlis natto），并于LB培养基斜面保存。

1.2 主要仪器与试剂

BS124S分析天平、HH.B11-40电热恒温培养箱、7230G型分光光度计等。葡萄糖、蛋白胨、无机盐类为国产试剂。

1.3 培养基

斜面培养基为普通营养肉汤琼脂培养基。液体种子培养基为LB液体培养基。

4 种不同碳源蛋白胨培养基分别为2%的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，其他成分相同，为1%蛋白胨、0.5%氯化钠，pH 7.0～7.2。固体和半固体培养基分别为加入2%和0.8%的琼脂粉。

4 种不同氮源的培养基分别将氮源换为同浓度的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵，其他成分不变。

上述培养基均采用121℃的高压蒸汽灭菌25min。

1.4 培养方法

1.4.1 种子液培养取斜面菌种，接种于液体种子培养基中，35℃，180 r/min摇床培养20 h。

1.4.2 摇瓶发酵培养接种量2%，35℃，180 r/min摇床培养。

1.4.3 制作纳豆精选优质东北大豆→清洗→浸泡过夜→蒸煮→沥干→冷却（37℃）→接种→发酵培养（35℃）→后熟→纳豆成品。发酵第24，32，48 h 进行观察。

1.5 检测方法

1.5.1 还原糖的测定 1.3中4种液体培养基采用费林试剂法从第16 h开始每隔4 h测定菌液的碳水化合物浓度。

1.5.2 生物量测定方法以接种前培养液为空白，测定各发酵液在600 nm处的OD值。

2 结果与分析

2.1 不同碳源种类对纳豆菌发酵的影响

按细菌生长特点，得到的发酵液含糖量逐渐降低。在细菌的对数期，主要是因为细菌繁殖消耗碳水化合物，细菌进入平稳期后，不仅是细菌消耗，更主要是纳豆菌分泌的各种酶分解营养物质。图1中，在同一时间，不同培养液的碳水化合物浓度是不同的。其中，葡萄糖浓度随时间的延长变化最大，其次是蔗糖，麦芽糖和可溶性淀粉最小。由此判断出，在纳豆发酵时，添加适量葡萄糖，效果是最好的。但由于葡萄糖不如蔗糖经济实惠，且蔗糖和葡萄糖的浓度差异并不大，在实际发酵过程中，可适当调整葡萄糖和蔗糖的比例后加入到要发酵的大豆中，可大幅度提高纳豆的发酵率。

在试验设计中，只涉及到了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉，这是实验室里最常用的、最易分解的淀粉。但试验设计的目的在于改进民间纳豆的制备方法，对于商业化生产纳豆和民间制备纳豆，在经济上，这并不实惠。纳豆生产后需低温贮藏，一般为-2～-4℃或-18℃以下。在如此低温条件下，为保持纳豆的品性，接种的纳豆菌在培养过程中，要产生大量芽孢。在培养基成分中,碳源及其浓度是影响芽孢形成的主要因素。与葡萄糖、乳糖等速效碳源相比较，在玉米淀粉、小麦淀粉等淀粉类长效碳源中，菌体生长较慢，14～16 h时生长进入平稳期，比葡萄糖、乳糖等速效碳源晚2～6 h。在芽孢形成方面,淀粉类碳源的芽孢形成缓慢[5]，但相比于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等糖类，玉米淀粉、小麦淀粉等淀粉类比较经济实惠。为提高产率，发酵前期可适当加入糖类物质，同时为在短时期内保证芽孢产率，要选择碳水化合物做复配发酵底物。

2.2 不同培养温度对纳豆菌发酵的影响

以葡萄糖蛋白胨培养基接种后分别在25，30，37，45℃下培养，其生长曲线如图2所示。由图2可明显看到，最佳培养发酵温度是37℃。虽然在45℃培养温度下培养液最早进入稳定期，但之后便一直处于一个较低的水平。37℃培养温度下，溶液的浑浊度始终比同时间培养条件下的其他培养液高，10 h后菌体则进入了稳定期和衰亡期。但是，培养温度对纳豆杆菌产生抗菌物质有较大影响，当温度为25，30℃时，抗菌活性高，35℃以上时抗菌活性下降[6]。纳豆的营养价值在于其抑制沙门氏菌、痢疾菌及O157∶H7大肠杆菌等致病菌的作用，以及它所分泌的纳豆激酶等能够促进人体健康，因此，发酵过程需要把温度控制在35℃以下，使之保持良好的分泌生理活性物质的状态。为了保持纳豆菌的繁殖速度为最佳，试验继续采用37℃的培养温度。

2.3 不同氮源种类对纳豆菌发酵的影响

将不同氮源的培养基接种培养，每隔4 h测定生物量，结果如图3所示。大豆蛋白胨作为氮源时，菌株对其的利用速度较快，在16 h达到最大生长量，明显好于其他3种氮源；其次是胰蛋白胨。而纳豆菌对无机氮源硝酸铵和硫酸铵的利用速度相对较慢，并且OD值一直处于较低的水平。因此，有机氮源可以促进纳豆菌生长，并且利于纳豆菌抗菌物质的产生[6]，由于大豆蛋白胨的成本低于胰蛋白胨，因此大豆蛋白胨可被选作最适氮源。

2.4 纳豆成品制作

按照1.4.3方法发酵纳豆，分为A，B 2组，其中A组加入1%的大豆蛋白胨、葡萄糖、蔗糖。结果如表1所示。

表1 纳豆制品发酵现象的观察

在制作纳豆过程当中发现，用改进后的方法做出来的纳豆，其发酵时间与效果明显优于用传统方法做出来的纳豆。A组纳豆产丝情况良好，新鲜的纳豆色泽金黄，口感酥软，用筷子挑起时有很长很长的丝状黏液物质，其主要成分是类果聚糖，即果糖和γ-多聚谷氨酸的混合物[7]。丝状黏性物质越多，说明纳豆的品质越佳，发酵得越好。纳豆本身的氨味非常浓厚，添加糖类物质后进行发酵，可以改善纳豆的口味。若糖类物质过多，会使纳豆稍有甜味，但适当添加时，糖类物质基本上都被分解，对口感影响不大。

纳豆发酵达不到好的效果，可能是培养条件不是最佳条件，也可能是接种的菌株不是最优良的菌株。试验初期应该选好发酵菌株，进行正向育种后再分离出菌株。