保肝汤对酒精性脂肪肝大鼠肝脂质过氧化和 CYP2E1表达的影响

江国荣 张露蓉 严 炜 任光荣 南京中医药大学附属苏州市

中医医院药剂科,中药研究所(苏州215003)

酒精性肝病在我国的发病率迅速增加,已成为危害国民健康的重大疾病。M ANN.R.E[1]等调查显示:重度饮酒者中80%有一定程度的酒精性脂肪肝,其中10%～ 35%可发展成酒精性肝炎和酒精性肝硬化[2]。酒精性脂肪肝肝脏损伤初期,也是临床防止该病病情进一步发展的重要环节,目前对酒精性脂肪肝的治疗仍以戒酒、营养支持为主。本文在中医临床验方保肝汤对酒精性脂肪肝具有防治作用的基础上,进一步从肝脂质过氧化和 CYP2E1表达角度,探讨保肝汤防治酒精性脂肪肝的作用机制,从而为提高临床疗效提供进一步的依据。

1 材 料 1.1 仪器 5810R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);FSH-2A可调高速均浆机(江苏金坛市医疗仪器厂);GeneAmP2400型 PCR仪 (美国 Perkin Elmer公司);Power PAC2000电泳仪 (Biorad公司);数码凝胶图像处理系统(GIS2008H)(上海天能科技有限公司)。

1.2 试药 保肝汤(丹参、山楂、葛根、决明子、三七等 ,饮片由苏州春晖堂饮片厂提供,由本实验室提取为相当于 1g生药◦mL-1的提取液);硫普罗宁片(河南省新谊药业股份有限公司 ,国药准字号 H10980086);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)试剂盒 (南京建成生物工程研究所);兔抗鼠 CYP2E1试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);免疫组化生物二抗试剂盒(上海基因科技有限公司);Trizol(美国 Invitrogen公司);RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司);自制饲料:采用普通饲料:猪油=85:15,充分混匀,制成成型饲料。

1.3 动物 清洁级 Wistar大鼠 ,雄性,体重 180±20g,购于浙江省实验动物中心。

2 方 法 2.1 大鼠酒精性脂肪肝模型的建立 参照文献[3]建立酒精性脂肪肝大鼠模型:前 3d以 15% (体积比 )白酒代替水给予饮用 ,第4天起按15mL◦ kg-1灌服52%(体积比)白酒,每日 1次;同时给予自制饲料,自由饮水。至第 4周末,形成酒精性脂肪肝模型。

2.2 动物分组与给药 取 Wistar大鼠,雄性,56只,随机分为 7组(n=8),分别设为以下组别:空白对照组:以同等剂量NS灌胃 8周;模型组:按 2.1方法造模 (4周)后,以 NS灌胃至 8周;保肝汤低、中、高三个剂量治疗组:按 2.1方法造模 (4周 )后 ,以 3.30g、7.50g、15.00g生药◦ kg-1灌胃至 8周;保肝汤防治组:按 2.1方法造模的同时,灌胃给予 7.50g生药◦ kg-1至 8周;硫普罗宁治疗组:按 2.1方法造模 4周后,以 40mg◦ kg-1灌胃至 8周[4]。 灌胃量均为 15mL◦ kg-1折算。

2.3 指标检测方法 在8周末处死大鼠。处死前禁食12h,以 2%戊巴比妥钠溶液 1mL◦ kg-1体重腹腔内注射麻醉[5],迅速取出肝脏,按常规制备肝匀浆、肝组织石蜡切片标本,部分肝组织于-80℃低温保存。肝组织中 SOD活力和 MDA含量按试剂盒步骤测定,并以考马斯亮兰法测定组织总蛋白的含量;肝组织中 CYP2E1采用 SABC法检测[6],依照试剂盒步骤进行操作;以 TRIzol法抽提肝组织中的总 RN A,RT-PCR根据逆转录反应试剂盒步骤操作;用数码凝胶图像处理系统对 RT-PCR产物电泳条带行密度分析,测定目的带及CYC条带的V值(Volume=平均吸光密度值×条带面积),目的条带表达强度 RV=V目的带 /CYC。

3 结 果 3.1 保肝汤对肝组织中M DA、SOD的影响模型组与空白对照组相比,MDA含量明显升高(P＜0.05),SOD活力明显降低(P＜0.05);保肝汤高、中剂量组、防治组和硫普罗宁组的 MDA含量较模型组明显降低(P＜0.05),SOD活力较模型组明显升高(P＜0.05);其中 MDA指标保肝汤中剂量组最好(与空白对照组比较 P＞0.05),SOD指标保肝汤中、高剂量组优于低剂量组 ,但防治组效果最好(与空白对照组比较 P＞ 0.05),见表 1。

表1 各组大鼠肝组织中MDA、SOD的比较(±s,n=8)

表1 各组大鼠肝组织中MDA、SOD的比较(±s,n=8)

与空白对照组比较:△P＜0.05,▲P＜0.01;与模型组比较:◇P＜0.05,◆P ＜0.01

组别 给药剂量(◦kg-1)MDA含量(nmol◦mg Prot-1)SO D活力(U◦mgProt-1)空白对照组 - 2.22± 0.71 201.94±20.26模型组 - 3.37± 1.66△ 178.48± 17.40▲保肝汤低剂量组 3.30 g生药 2.74±1.18 183.62±17.44保肝汤中剂量组 7.50 g生药 2.25±0.50◇ 197.03±9.49◇保肝汤高剂量组 15.00 g生药 2.49±0.52 196.68±16.61◇保肝汤防治组 7.50 g生药 2.35±0.31◇ 203.23±18.55◆硫普罗宁组 60mg 2.17± 0.79◇ 197.90± 18.67◇

3.2 保肝汤对肝组织 CYP2E1表达的影响 光镜下显示:空白对照组肝组织胞浆中染成棕黄色颗粒的 CYP2E1的表达局限,仅于中央静脉周围的少数几个肝细胞,不超过2～ 3个细胞层的厚度;模型组可见 CYP2E1表达的强度增强,出现大量深染的棕黄色阳性颗粒,呈弥散性分布,其分布与肝细胞脂肪变的分布具有一致性 (与空白对照组比较 P＜0.01)(图 1);各药物组的 CYP2E1的表达分布方式也呈弥散性,但强度受到不同程度的抑制(与模型组比较P＜0.01),保肝汤中剂量组和防治组效果最佳(与空白对照组比较 P＞0.05),仅见少量CYP2E1表达 (图 2、 3),结果见表 2。

3.3 保肝汤对 CYP2E1/CYCmRN A表达的影响 凝胶电泳和数据图像处理结果显示,CYP2E1mRN A表达,模型组比空白对照组表达增强(P＜0.01);各给药组均较模型组其表达均有不同程度降低(P＜0.01),结果见表 3和图 4。

表2 各组CYP2E1免疫组化结果比较(n=8)

图1 CYP2E1在模型组肝组织细胞浆中的表达(×200)

图2 CYP2E1在防治组肝组织细胞膜和细胞浆中的表达(×200)

图3 CYP2E1在中剂量肝组织细胞浆中的表达 (×200)

表3 各组大鼠 CYP2E1/CYCm RNA表达(n=3)

图4 各组大鼠CYP2E1mRN A表达1:模型组;2:空白对照组;3:防治组;4:低剂量组;5:中剂量组;6:高剂量组。

4 讨 论 中医学认为,过量饮酒,酒毒湿热之邪蕴积中焦,伤及脾胃,脾胃失运,湿浊内生,湿热蕴结,或停于脘腹,或阻于胁下,而出现胃痞、伤酒、胁痛等证。酒伤肝脾,聚湿生痰,痰湿瘀毒互结为本病之关键病机,宜以祛湿化痰、活血化瘀等法贯穿治疗的始终。现代实验研究也表明,中医中药在预防和治疗酒精性脂肪肝方面显示出较好的优势。保肝汤由丹参、山楂、葛根、决明子、三七等药组成,组方精炼,药少力专 ,具化瘀祛痰功效,治疗酒精性肝病 ,尤其是酒精性脂肪肝,取得了良好的临床效果。前期实验结果(另文发表)也显示,保肝汤能明显减轻模型鼠肝组织细胞的脂肪变性,起到保护、恢复肝脏功能的作用。

氧化应激与脂质过氧化在酒精性脂肪肝的形成中有重要作用[7]。乙醇及其代谢产物可对机体的氧化-还原反应造成影响,诱导超氧阴离子的生成,消耗自由基清除剂还原型谷胱甘肽(GSH),降低细胞中 GSH的水平,从而使血清自由基增多,氧化肝细胞膜的多不饱和脂肪酸和蛋白质,形成脂质过氧化物(LPO),致肝细胞结构和功能的损害。丙二醛(M DA)是重要的脂质过氧化产物,对组织细胞有很强的毒性作用,可作用于核因子 N F-κB,结果使致炎因子表达释放增加;还可与 Kupffer细胞及肝细胞释放的细胞因子一起进一步介导肝细胞损伤,从而使肝脏炎症进一步加重[8];使细胞膜的流动性和通透性发生障碍,最终导致肝细胞结构与功能损害。因而MDA的含量可反映组织过氧化损伤程度[9],间接反映细胞的损伤情况。SOD可以通过歧化作用清除体内氧自由基,从而减少脂质过氧化反应,维持生物膜的正常结构和功能,其水平高低反应了机体抗氧化能力的强弱。徐中南等[10]研究显示,对酒精性脂肪肝大鼠用药后,明显提高肝组织 SOD活性,降低 M DA含量,其部分机制抗脂质过氧化和增加脂质代谢有关。联合检测SOD活力及MDA含量,能间接反映机体脂质过氧化反应对组织的损伤程度。本实验结果显示:模型组大鼠 SOD活性明显降低,M DA含量明显升高,说明灌服白酒的大鼠体内氧自由基生成增多,脂质过氧化情况严重,因而肝脏损伤明显。保肝汤中、高剂量组、防治组和硫普罗宁组较模型组明显改善,其中保肝汤中剂量组和防治组效果最好(与空白组相似),而低剂量组对 SOD、M DA影响与模型组无明显差异,表明复方药物的剂量及疗程对药物发挥作用可能存在影响。

乙醇在肝内主要通过三个酶系统被氧化:乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)、微粒体乙醇氧化酶系统(micro-somal ethanol-oxidizing system,MEOS)和过氧化物酶体中的过氧化物酶。M EO S是一组混合功能氧化酶系,其催化作用有赖于细胞色素 P450的参与,与酒精代谢密切相关的为细胞色素 P4502E1(CYP2E1)[11]。其在酒精的氧化代谢产生自由基和启动脂质过氧化过程及肝脏损害中起着重要的作用[12]。乙醇可以提高 CYP2E1的基因和蛋白表达,激活磷脂酶及脂质过氧化反应。当血液中的乙醇含量超过 10%时,M EOS系即将参与乙醇的氧化过程。CYP2E1具有很强的N ADPH氧化活性,能氧化乙醇生成乙醛,产生大量活性氧中间产物并激活Kupffer细胞释放炎症因子 ,使反应性氧增多;随着 CYP2E1表达的增强,SOD、GSH、VitE的含量均显著下降。由于脂质过氧化反应的增强而抗氧化能力的下降,导致自由基的生成增多,进一步促进脂质过氧化反应,使M DA生成增加,最终导致肝细胞结构与功能的损害。研究发现,CYP2E1表达随脂肪肝程度的加重,表达逐渐增高[13]。 CYP2E1抑制剂可以对抗由于乙醇、游离脂肪酸等诱导的 CYP2E1过表达而致的氧应激和脂质过氧化[14],因而寻找安全有效的CYP2E1抑制剂可能成为预防和治疗脂肪性肝病的一条新途径。本研究肝组织CYP2E1免疫组化结果显示,空白组大鼠肝组织切片中染成棕黄色颗粒的CYP2E1主要分布于中央静脉周围的少数肝细胞,模型组大鼠有强烈表达,以发生脂肪变的肝细胞更为明显,各用药组表达强度及范围均显著减少,保肝中剂组及防治组效果最佳,仅见少量CYP2E1表达。RT-PCR测定CYP2E1mRNA表达显示:模型组 CYP2E1mRNA与空白组比较表达显著增加,各用药组CYP2E1mRN A表达与模型组比较显著降低,其中也以保肝防治组及中剂量治疗组效果较好。综合以上实验结果说明:保肝汤能清除过多的自由基,阻断氧自由基介导的脂质过氧化反应,阻止脂质过氧化物的产生,阻止肝细胞的脂肪变性和肝脏损伤,促进肝内脂质代谢。可能为保肝汤防治酒精性脂肪肝的作用机制之一;复方不同剂量及不同疗程比较,提示保肝汤中剂量治疗组效果较好,和由单一预防或治疗为主转向防治并用时效果更佳。

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