脂脉宁对酒精性脂肪肝大鼠血清 TNF-α和 IL-8的影响*

河北省邢台市人民医院 解庆凡 王建华 张一昕 王晓贞 郭文平 （邢台 054031）

脂脉宁为课题组在长期临床实践过程中自行研制的治疗酒精性脂肪肝 （AFL）的有效中药制剂,经多年临床运用证实,疗效确切。[1]据报道,细胞因子的启动和致敏是脂肪肝肝损害中的关键一步。[2]为了探讨脂脉宁的作用机理,笔者观察了其对 AFL模型大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的影响。

1 材料

1.1 动物 健康 wistar大鼠 70只,♂,清洁级,体重160～180 g,购自河北省实验动物中心 （合格证号:1003046）。

1.2 药物 脂脉宁组成:泽泻、姜黄、山楂、石菖蒲、皂角、大黄、何首乌等。由我院制剂室制成胶囊制剂,实验时用蒸馏水配制成所需浓度。东宝肝泰片:通化东宝药业股份有限公司出品,批号为 H 22024764。实验时用 0.5%的羧甲基纤维素钠配制成所需浓度的混悬液。

1.3 试剂来源 天门冬氨酸氨基转移酶 （AST）、丙氨酸氨基转移酶 （ALT）、总胆固醇 （TC）、甘油三酯 （TG）试剂盒均由北京中生生物工程高技术公司提供,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素 8（IL-8）放免试剂盒均购自解放军总医院科技开发中心放免所,胆固醇、胆盐均购自北京奥博星生物技术责任有限公司,56度红星二锅头白酒 （北京红星二锅头酒厂生产）。

1.4 主要仪器 半自动生化分析仪 （德国毫迈克公司）、FJ-2020型 γ射线免疫计数器 （国营 262厂）、MSE-25型高速冷冻离心机 （上海安亭科学仪器厂）。

2 方法

2.1 动物分组 将 70只健康雄性 wistar大鼠,饲养于18℃～22℃明暗各 12 h的清洁级动物实验室内,正常喂养1周后,按体质量随机分为5组,即:正常对照组 （简称正常组）、模型对照组 （简称模型组）、脂脉宁高、低剂量组（简称高、低剂量组）、东宝肝泰对照组（简称对照组）。除正常组 10只外,其余各组均为 15只。

2.2 造模与给药 正常组用蒸馏水灌胃,进食普通饲料,自由饮水。其余各组参照相关文献[3-4]加以改良,用56%红星二锅头灌胃,浓度从 30%逐渐升至 56%,梯度为每周升高 5%,于第 6周直接升至 56%,并持续至第 8周,同时喂饲高脂饲料 （由 1.5%胆固醇、0.5%胆盐、10%猪油和 88%基础饲料制成）,自由饮水。大鼠造模的同时给药治疗,正常组和模型组给予蒸馏水灌胃,脂脉宁高、低剂量组和对照组分别给予相应药物灌胃。1次/d,每次用药体积均按 1mL/100 g计算,持续 8周。

2.3 标本处理 实验8周末,于最后 1次给药后禁食 12 h麻醉状态下取血,将血样低温离心,分离血清,密封,-20℃冷存待检。取血后迅速剖取肝脏,在肝脏最大叶距边缘 0.5 cm处取 0.5×0.5 cm大小肝组织,用 4%的多聚甲醛固定。另取适量肝组织用冰生理盐水冲洗,滤纸吸湿后,称取湿重 0.3 g左右,加入预冷的生理盐水,冰水中制成 10%匀浆,4℃4 000 r/min离心 10m in,提取上清液,-20℃冷存待检。

2.4 检测指标

2.4.1 肝组织病理形态学观察:取用 4%的多聚甲醛固定肝组织,常规石蜡包埋切片,HE染色,光学显微镜观察。

2.4.2 血脂和肝功能检测:取血清在半自动生化分析仪上测定 TC、TG、AST、ALT

2.4.3 血清TNF-α和 IL-8的测定:采用放射免疫法,严格按试剂盒说明书操作。

3 结果

3.1 各组大鼠肝脏病理形态学变化 HE染色后光镜下观察:正常组大鼠肝小叶结构正常,中央静脉大而壁薄,肝细胞排列成肝索,在中央静脉周围呈放射状分布,细胞呈多边形,无浊肿、坏死,胞浆无脂滴,无炎性细胞浸润。模型组大鼠肝小叶结构不清,肝细胞索紊乱,肝窦变窄,多数肝细胞浊肿、明显脂肪变性,脂滴以大泡型为主,可见点状坏死和炎症细胞浸润。各治疗组大鼠肝小叶结构清晰,肝细胞脂肪变性明显好转,肝细胞排列整齐,肝窦基本恢复正常,少量肝细胞浊肿,无炎细胞浸润和坏死。

3.2 脂脉宁对 AFL大鼠血清 TC、TG、ALT、AST的影响 与正常组比较,模型组大鼠血清 TC、TG、ALT、AST的含量异常升高 （P＜0.01）,显示 AFL大鼠存在着明显的血脂代谢紊乱和肝功能异常。给药后,脂脉宁高、低剂量组和对照组均能显著降低实验大鼠血清 TC、TG、ALT、AST的含量,与模型组比较差异均具有显著性 （P＜0.05或 P＜0.01）。其中,高剂量组明显优于对照组 （P＜0.05或 P＜0.01）。结果详见表 1。

表1 各组大鼠血清 TG、TC、AST、ALT的变化情况 （±s）

表1 各组大鼠血清 TG、TC、AST、ALT的变化情况 （±s）

注:与模型组比较,*P＜0.01,**P＜0.05;与对照组比较,△P＜0.05,△△P＜0.01

组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） ALT（U/L） AST（U/L）正常组 0.78±0.11* 1.47±0.16* 56.51±7.68* 81.33±9.59*模型组 1.69±0.16 3.65±0.32 125.36±13.93 207.52±15.82高剂量组 0.81±0.13*△△ 1.63±0.21*△ 44.27±6.38*△ 104.71±9.28*△△低剂量组 0.96±0.12* 1.65±0.26*△ 52.38±5.83* 130.73±11.02*对照组 1.02±0.17* 1.98±0.25* 57.62±8.01* 136.56±10.48*

3.3 脂脉宁胶囊对 AFL大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的影响 与正常组比较,模型组大鼠血清 TNF-α和IL-8的含量均较正常组异常升高 （P＜0.01）;给药后各治疗组大鼠血清 TNF-α和 IL-8的含量均低于模型组 （P＜0.01）;其中,高、低剂量组血清TNF-α含量均低于对照组;高剂量组血清 IL-8含量低于低剂量组和对照组 （P＜0.05）。结果详见表 2。

表2 各组大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的比较 （±s）

表2 各组大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的比较 （±s）

注:与模型组比较,*P＜0.01;与对照组比较,△P＜0.05;与高剂量组比较,▲P＜0.05

分组 TNF-α（ng/mL） IL-8（pg/mL）正常组 0.93±0.15* 195.78±15.34*模型组 1.76±0.26 268.76±26.15高剂量组 1.09±0.23*△ 130.81±11.55*△低剂量组 1.13±0.18*△ 179.46±21.66*▲对照组 1.39±0.21* 186.82±19.31*

4 讨论

AFL在中医学中无独立的病名,根据其病因、病机及临床表现,可归属于中医学的 “酒疸、胁痛、伤酒、酒癖、酒胀、酒劳、积聚”等范畴。中医学认为酒为湿热有毒之邪气,味甘、苦、辛,性温,有毒;归心、肝、脾、胃经。过量饮用则酒毒湿热蕴结于中焦,损伤脾胃,湿浊内生,聚湿生痰,痰阻气滞,肝失疏泄,气滞血瘀,痰湿瘀毒相搏,结于胁下而成此病。病情缠绵不愈,日久则耗伤肝肾之阴。因此湿热痰瘀互结,肝脾失调为 AFL的主要病机,故脂脉宁选用泽泻利湿消痰、泄热;皂角祛痰散结;姜黄、山楂疏肝行气、祛瘀通络;石菖蒲、白术祛湿健脾;大黄通腑导滞,排除湿毒瘀积;何首乌补肝肾、益精血。诸药合用,共奏除湿泄热、疏肝活血、健脾益肾之功。

肝脏是人体的重要解毒器官,酒精的解毒代谢过程主要在肝脏中进行,长期大量摄入酒精性饮品,酒精代谢产物直接刺激肌体产生内毒素,肝内蓄积的酒精及其氧化代谢产物可直接刺激肌体产生内毒素。血中内毒素升高,刺激激活肝脏 Kupffer细胞产生大量核转录因子,如 NF-κB、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、前列腺素 E2（PGE2）等。NF-κB诱导激活肝脏 Kupffer细胞,释放大量IL-6、IL-8等炎症因子。TNF-α可直接引起肝细胞脂肪变性、炎症及肝细胞坏死。[2]IL-8为中性粒细胞活化及趋化性刺激因子,可促使炎症细胞,如活化的中性粒细胞聚集至肝脏,引起炎症。TNF-α还可以诱导 IL-6、IL-8等细胞因子的释放,促进肝细胞内中性粒细胞浸润,并通过脂质过氧化使细胞受损,最终导致细胞死亡。酒精性肝病患者血清 IL-8浓度与肝脏内浸润中性粒细胞的数目密切相关,临床研究表明,ALD病人血清中 IL-8水平明显高于正常人。[5-6]本研究结果显示,模型组大鼠血清中 TC、TG、AST、ALT、MDA、TNF-α和 IL-8的含量明显升高,镜下可见肝小叶结构紊乱,肝细胞索紊乱,肝细胞呈大泡样脂肪变性,并可见坏死灶和炎症细胞浸润。经过药物治疗后,血清中 TC、TG、AST、ALT、TNF-α和 IL-8的含量明显降低,肝脏组织结构明显改善。这种抑制细胞因子的分泌和释放,调节免疫的作用,可能是脂脉宁治疗AFL的作用机制之一。

[1] 王晓贞.脂脉宁治疗酒精性脂肪肝临床疗效观察 [1].辽宁中医药大学学报,2010,12（2）:60-61

[2] 韩婷,井源,吴静,等 .酒精性脂肪肝的肝损伤机制研究近况 [1].实用肝脏病杂志,2007,10（4）:279-281

[3] 古赛,蒋小黎,何琳,等 .大鼠慢性酒精性脂肪肝模型的建立 [J].重庆医科大学学报,2006,31（1）:81

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（2010-11-18 收稿）