猪源耐药性大肠杆菌的分离鉴定

杭柏林,秦治国,付登峰,胡建和

（1.河南科技学院,河南新乡 453003；2.辉县市畜牧局,河南辉县 453600）

大肠杆菌病（colibacillosis）是人和多种动物共患的细菌性传染病,对畜牧业造成的损害日益显著[1].猪大肠杆菌病是较为常见的一种大肠杆菌病.猪大肠杆菌病是由某些具有致病性的大肠杆菌（E.coli）所引起的仔猪传染病,主要包括仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病,在规模化猪场的发病率和死亡率都较高,给养猪业造成了极大的经济损失[1-2].目前,在防治猪大肠杆菌病时多广泛使用抗生素.但由于抗生素的不合理使用导致细菌耐药性的产生和扩散比较严重,使得猪大肠杆菌病的防控更加困难[3].为此,本研究采集了患黄痢、白痢仔猪的病料,进行了致病性大肠杆菌的分离鉴定,并进行了耐药性检测和分析,旨在为临床上有针对性地防治猪大肠杆菌病提供帮助.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 采集原阳县某养猪场患黄痢、白痢仔猪的新鲜粪便、肝脏、脾脏和心血等病料共10份,用保温杯冰袋冷藏保存,于3 h内送到实验室待检.

1.1.2 试验动物 试验用6只小白鼠（16～20 g）购于新乡医学院实验动物中心.

1.1.3 培养基与试剂 普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基和药敏纸片均为本实验室自行制备并保存.微量生化反应管购自杭州微生物试剂有限公司.各种抗生素购自河南科技学院动物医院.其他均为常规试剂.

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离 将粪便和血液用灭菌生理盐水进行稀释,取不同稀释度的稀释液0.5mL用涂布法接种普通营养琼脂培养基.肝脏和脾脏用剪刀以烫灼法进行表面消毒,以无菌镊子取一小块组织用涂布法接种普通营养琼脂培养基.37℃恒温培养18～24 h后观察细菌生长情况和菌落特征.挑取单个菌落接种于麦康凯琼脂平板,37℃恒温培养18～24 h,挑取红色、中等大小、光滑的可疑菌落进行涂片、革兰染色和镜检.革兰染色、形态、大小等均符合大肠杆菌特征的菌株初步确定为大肠杆菌,并用普通营养琼脂纯化,以供作细菌生理生化鉴定.

1.2.2 细菌生化鉴定 按照文献[4]的方法进行.对疑似大肠杆菌的菌株进行吲哚试验、甲基红试验、维倍（VP）试验、硫化氢（H2S）试验、枸橼酸盐利用试验和5种糖类发酵试验.

1.2.3 致病性试验 为了鉴定所分离的大肠杆菌是否具有致病性,使用小白鼠进行动物试验.按照文献[5]的方法进行.将生化鉴定为大肠杆菌阳性的菌株纯培养物接种普通营养琼脂培养18～24 h,用灭菌生理盐水洗下,调节菌悬液的细菌浓度约为2.0×108CFU/mL,通过腹腔途径注射5只健康小白鼠0.5mL/只.对照组小白鼠注射等量的灭菌生理盐水.小白鼠死亡后进行剖检观察,将病变明显组织按方法1.2.1中心血、肝脏和脾脏的方法进行接种,若培养特性、形态、染色反应和生理生化鉴定等均符合大肠杆的菌株则判定为致病性大肠杆菌.

1.2.4 药敏试验 采用圆纸片法进行.取37℃培养18 h的致病性大肠杆菌,置于1mL灭菌生理盐水中,充分混合后用移液枪吸取150μL,均匀涂布于普通营养琼脂培养基表面.待琼脂表面干燥后,用灭菌镊子小心取已备好的各种药敏纸片,包括青霉素、链霉素、庆大霉素、利福平、阿米卡星、阿莫西林、沙拉沙星、洛美沙星、头孢噻呋,每个药敏纸片设3个重复.37℃恒温培养24 h,测定抑菌圈直径.判定标准：抑菌圈直径大于20mm为极度敏感,15.1～20mm为高度敏感,10.1～15mm为中度敏感,0～10mm为耐药[6].

1.3 数据处理

对测得的抑菌数据用平均值±标准差表示.

2 结果与分析

2.1 细菌分离与培养结果

采集的10份病料中,5份病料中的细菌在普通营养琼脂培养基上长出灰白色、圆形、稍隆起、光滑、湿润、边缘整齐的中等大小菌落（直径约1～2mm）,在麦康凯培养基上长出砖红色、圆形隆起、光滑、湿润、边缘整齐的菌落.将以上培养物进行常规涂片,革兰染色后镜检,见到革兰阴性、中等大小的杆菌.将培养特征和镜检特征比对文献[1]中大肠杆菌的特征描述,认为分离到疑似大肠杆菌菌株5株.

2.2 细菌生理生化鉴定结果

5株疑似大肠杆菌菌株的生理生化鉴定结果如表1所示.将5株疑似菌株的生理生化试验结果与参考文献[1]中大肠杆菌生理生化特性的描述进行比对,确定分离到的5株疑似大肠杆菌菌株均为大肠杆菌.

表1 细菌生理生化试验结果

2.3 致病性试验结果

分离菌株接种小白鼠后,均致试验组小白鼠出现症状：精神沉郁,体温升高,采食量大幅减少；而对照组均健康存活.剖检死亡鼠和病鼠,可见肝严重出血,或呈现暗红色,脾和肾表面有出血点,肠黏膜有出血、水肿现象,肠内容物稀薄,有气泡.从死亡或发病小白鼠的心血、肝、脾都能分离细菌,经培养、镜检和生理生化鉴定为大肠杆菌.这表明,所分离到的5株大肠杆菌均具有致病性.

2.4 药敏试验结果

5株致病性大肠杆菌的药敏试验结果如表2所示.从表2中可以看出,就受试抗生素而言,第2株猪致病性大肠杆菌为耐药菌株,对所试抗生素均耐药；第1株对沙拉沙星和洛美沙星极度敏感,对利福平、阿莫西林和头孢噻呋耐药；第3株对阿米卡星和洛美沙星极度敏感,未出现耐药性；第4株对对青霉素、链霉素、沙拉沙星和洛美沙星极度敏感,未出现耐药性；第5株对链霉素和阿米卡星极度敏感,未出现耐药性.

表2 药敏试验结果 （抑菌圈直径,单位：mm）

3 小结与讨论

3.1 大肠杆菌的分离与鉴定

大肠杆菌为革兰阴性无芽胞的短小杆菌,在普通光学显微镜下很难与沙门菌等肠杆菌科的细菌相区别.因此,要鉴定所分离的细菌是否是大肠杆菌还必须进行细菌生理生化鉴定.大肠杆菌有致病性和非致病性菌株之分,因此分离鉴定出大肠杆菌后必须通过动物致病性试验鉴定所分离的大肠杆菌是否有致病性[7].本次送检了10份病料,却只分离到5株大肠杆菌.这可能与采集的病料标本有关,特别是抗生素的使用导致了标本中细菌分离率的降低[2].

3.2 大肠杆菌的耐药性

为控制细菌感染,于饲料中盲目添加一些抗菌药物,会导致耐药菌株越来越多并日趋严重.大肠杆菌可通过菌毛将其抗药性质粒传递给其他大肠杆菌,所以大肠杆菌的抗药性形成较快,环境中大肠杆菌的耐药性菌株越来越多[8].细菌耐药性的产生和扩散不仅给控制和治疗疫病带来困难,而且严重危害动物性食品安全,且给人类生命健康造成威胁[9].因此,要合理使用抗菌药物.应严格掌握抗菌药物的适应症、剂量和疗程,杜绝或尽量少用抗菌药物作为饲料添加剂.细菌耐药性的产生与扩散使得研发新型抗菌物质变得更为迫切.

目前,动物源性大肠杆菌耐药性呈现出以多重耐药为主的趋势[2-3].这种多重耐药性产生的原因可能与猪饲料中长期使用某些抗生素或滥用抗生素有关[10].本次试验分离的2株猪源耐药性大肠杆菌菌株也表现为多重耐药（第1株对3种抗生素耐药,第2株对9种抗生素耐药）.但是,像第2株对9种抗生素耐药的现象还不多见.

[1]陈溥言.兽医传染病学[M].北京：中国农业出版社,2006：111-119.

[2]夏伦斌,左瑞华,葛凯,等.规模化猪场致病性大肠杆菌的耐药性分析[J].中国畜牧兽医,2010,37（6）：183-185.

[3]易本驰,陈敏,何敏,等.信阳地区规模化猪场大肠杆菌耐药性监测[J].中国兽医杂志,2010,46（2）：25-26.

[4]胡建和,王丽荣,杭柏林.动物微生物学[M].北京：中国农业科学技术出版社,2006：398-406.

[5]史丽华.仔猪致病性大肠杆菌的分离与鉴定[J].中国兽医杂志,2010,46（6）：53-54.

[6]朱模忠.兽药手册[M].北京：化学工业出版社,2002：42-43.

[7]杭柏林,李杰,王丽荣,等.鸡源致病性大肠杆菌分离株的药敏试验及灭活疫苗制备[J].安徽农业科学,2006,34（22）：5877-5878.

[8]刁有祥,李久芹,陈庆普.山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报,2002,24（1）：21-23.

[9]JindalA,Kocherginskaya S,Mehboob A,etal.Antimicrobialuseand resistance in swinewaste treatmentsystems[J].ApplEnviron Microbiol,2006,72（12）：7813-7820.

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