生长因子在动物细胞培养中的作用

陈维

(鲁东大学生命科学学院)

1 细胞培养的研究历程

1885年，Roux最早使用温生理盐水使鸡胚组织在体外生存长达数月，开启了体外组织培养的萌芽时代。1907年，美国胚胎学家Ross Harrison 采用青蛙淋巴液做培养基，悬滴法使蛙胚神经管区的一片组织在体外得以生长，从而建立了动物细胞培养的基本模式系统。之后又有许多学者对细胞培养的技术进行改进，1912年，Carrel采用血浆包埋组织块外加胚汁的培养方法（悬滴法的一种），培养鸡胚心肌组织长达数年之久。从此，细胞培养的基本技术建立起来。之后，科学家又在悬滴法的基础上，不断进行改进，优化培养条件，建立了单层细胞培养法、三维立体细胞培养法。利用体外培养技术，科学家建立了可以长期在体外生长培养的细胞株，其中，1943年，Earle建立的小鼠皮下组织L细胞株是最早建立的细胞株，给研究工作带来了很大的方便。在此基础上又相继建立了许多细胞株，如Hela（1952年）、KB（1954年）、CHO（1957年）、NIH3T3（1970年）、Friend（1974年）、HL60（1977年）、COS-1（1981年）等。

目前细胞培养的技术已广泛的应用于生物学的各个领域，如细胞生物学、分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学等研究。另外在医学方面也有很重要的应用价值。由于经过体外培养的细胞，其结构功能都十分接近体内情况，因此他们可以作为生物学的研究对象从而替代某些珍稀物种、进行医学鉴定等。

纵使研究者想尽各种方法尽可能的模拟细胞的体内环境使其在体外进行与体内同样的生长和传代，但是始终无法做到完全相同。除了需要满足水分、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及温度、pH、渗透压等物质和条件外，还需要生长因子等特殊的成分，体外的细胞才可能达到与体内近乎相同的生长形态。

2 生长因子的发现

1986年，Levi-montalcini和Stanley Cohen因为发现神经生长因子和表皮生长因子以及它们的作用特征而荣获诺贝尔医学或生理学奖[1]。神经生长因子（NGF）是最先被发现的生长因子。20世纪50年代初，Levi-montalcini在美国华盛顿大学的实验室中进行外周组织对神经细胞的生长和存活之影响的研究中发现：把鼠的肿瘤移植到鸡的胚胎中，可产生一种弥散性的物质，这种物质能够刺激神经细胞的生长。并在以后的工作中与Stanley Cohen利用组织培养的方法分离出这种物质，命名为神经生长因子。Levi-montalcini不但是神经生长因子最早的发现者，她同时也是最早向体外培养细胞中加入生长因子的科学家。在随后的几十年中，科学家确定了NGF的化学成分、结构及作用机制。1962年，Stanley Cohen在实验中，将含有NGF的唾液腺细胞提取物注射到新生小鼠体内时，发现小鼠的眼皮及牙齿有早熟的现象。因为这种物质能刺激皮肤及角膜中表皮细胞的生长，Stanley Cohen称之为表皮生长因子（EGF），之后，他又明确了EGF的结构[2]。

EGF和NGF的发现以及之后对它们结构、作用机制的研究过程中，组织和器官的体外培养技术发挥了很重要的作用。因为研究者是在观察整个实验个体时，发现了这一物质，但如果想进一步证实是一种新物质，就必须进行细胞的体外培养才能尽可能的排除个体中其他物质对其的干扰，使实验更有说服力。

Levi-montalcini和Stanley Cohen开创了研究生长因子的新领域，越来越多的研究者投身其中。各种不同功能的生长因子也相继被发现：20世纪80年代，在Moloney小鼠肉瘤病毒转化的3T3纤维母细胞条件化培养基中发现了转化生长因子[3]；1982年Gambarini等从牛垂体分离、纯化了酸性成纤维细胞生长因子；在两年后Bohlen等，取牛脑或垂体经CMSephadex C-50，肝素-Sepharose亲和层析，获得了纯化的碱性成纤维细胞生长因子[4]。

3 生长因子的分类

根据每种生长因子最初的发现组织不同，可以将生长因子分为神经细胞生长因子、表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及各种组织生长因子。各种生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的形态（分化或未分化）具有十分重要的作用。神经细胞生长因子是最早被发现目前研究最为透彻的生长因子，它具有营养神经元和促突起生长双重生物学功能，并对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。研究表明，神经细胞生长因子可以抑制某些肿瘤的有丝分裂，促其向良性分化，在神经母细胞瘤和胶质瘤的体外培养细胞中，也发现有促进分化作用[5]。神经细胞生长因子能否成为临床治疗恶性肿瘤的一种新制剂，有待于进一步研究。表皮生长因子是最早确立结构的生长因子，表皮生长因子可以促进细胞有丝分裂以及糖、蛋白质、DNA、RNA合成；在促进细胞增殖的同时可以抑制细胞的衰老[6]，最近的研究发现表皮生长因子对于传代培养的大鼠生长板软骨细胞[7]以及体外培养的人角质细胞[8]的增殖具有一定的促进作用。成纤维细胞生长因子又可以分为酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维生长因子，二者均可以在体外环境下刺激中胚叶来源的成纤维细胞或内皮细胞的增殖，另外碱性FGF还是有效的血管生成剂。研究证实，碱性FGF可以刺激体外兔干细胞的增殖和代谢[9]。

生长因子还可以分为内源性生长因子和外源性生长因子，外源生长因子即直接从生物体提取的成品生长因子，但是实验中通常采用转染的方法将编码生长因子的基因序列导入到受体细胞中，从而使生长因子在细胞体内表达来促进细胞的生长、分化和繁殖。内源性生长因子较外源性生长因子的优点在于它可以在细胞体内持续高效的发挥作用，还可以通过调控释放来避免由于一次大量给药而产生的潜在药物毒性，能为组织再生提供最佳的有效剂量[10]。

3.1 外源转内源的原因

现阶段在细胞培养中使用的生长因子多为外源型的，即直接在培养基中加入成品生长因子，外源生长因子的半衰期短，局部使用容易被稀释，而且需要反复给药。另外，无论从浓度上还是从生长因子的种类上说都是凭经验，没有具体的加入剂量和加入种类。因此在实验中生长因子的量同样也是影响细胞培养的因素之一。再者，现阶段使用的生长因子大多是从胎牛血清中提取的，价格相对来说较昂贵，不适合在实验中广泛使用。如果将编码生长因子的基因导入到待培养的细胞基因组中，使其成为内源型生长因子，可以大大降低生长因子的成本，另外对于细胞所需要的生长因子的浓度可以通过基因调控来控制，从而使生长因子在实验中发挥最重要的作用。由于在细胞培养过程中往往不仅仅只加入一种生长因子，因此在制备内源型生长因子时可以一次性将多种生长因子的基因导入到受体细胞中，以表达不同的生长因子。

3.1.1 转染生长因子基因的步骤

目前在干细胞培养及促进细胞分化中应用细胞生长因子的例子比较多，例如将胰岛素样生长因子的基因转染至兔脂肪间质干细胞中以促进细胞的增值[10]。主要实验方法如下：对以获取的组织细胞进行原代培养，并进行传代；细胞活力、密度以及各特性的鉴定；符合条件后，将含有生长因子基因的质粒载体转染至细胞中并进行传代培养；以未转染组和转染空质粒载体的细胞作为空白对照，进行转染后的鉴定。主要的鉴定方法有：应用RT-PCR对生长因子mRNA的表达情况进行鉴定；应用Western blot法检测生长因子蛋白的表达情况。

4 生长因子作用的分子学机制

生长因子作为一种信号分子它是一种局部介质，它能够调节多细胞生物的细胞生长和分裂，作用的靶细胞主要是临近的细胞。由于生长因子的大多数是亲水性物质，因此它不能穿过靶细胞质膜的脂双分子层，只能通过与细胞表面的受体结合，在经信号转换机制，在细胞内产生第二信使或激活蛋白激酶或蛋白磷酸酶的活性，从而引起细胞的应答反应，促进细胞的增殖和生长。不同的生长因子具有不同的受体进行信号转导：表皮生长因子的受体为，酪氨酸既没活性的多功能跨膜糖蛋白；神经细胞生长因子的受体为，低亲和力的神经生长因子受体和高亲和力的酪氨酸激酶家族受体；成纤维细胞生长因子的受体有三种，酪氨酸激酶受体、富胱氨酸成纤维细胞生长因子受体以及低亲和力的受体肝素硫酸糖蛋白；转化生长因子的受体为，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体。

5 各种生长因子在细胞培养中的研究历程

5.1 神经细胞生长因子在细胞培养中的应用

神经生长因子是最早被发现的生长因子，同时它也是最早应用于体外细胞的一类生长因子，在Levi-montalcini发现并证实了神经细胞生长因子存在后，它向体外培养的鸡胚中加入该生长因子，观察其对鸡胚中神经细胞生长的促进作用。研究发现神经细胞生长因子能使感觉神经节及交感神经节数目增加，体积增大，神经纤维延长。神经细胞生长因子对正常神经系统发育、分化及维持神经元特殊功能有重要的作用，在神经系统损伤后起修复、营养作用[11]。神经细胞生长因子不仅对神经系统，而且对内分泌和免疫系统都发挥重要的作用，是一种能抵抗各种疾病的全能武器，正如Levi-Montilini所说，NGF的临床应用有着迷人的希望。

在对细胞进行体外培养的时候，NGF也经常被用到。研究发现，在观察神经生长因子对体外培养的垂体催乳素瘤细胞的作用时发现NGF可以刺激人的垂体PRL分泌腺瘤细胞激素从而间接起到抑制肿瘤细胞增殖的作用最适合，所使用浓度为2 ng/μl[12]；NGF还可以促进人牙乳头间充质细胞的增殖，其浓度为100 U/mL时刺激细胞的增殖作用最强，当浓度为1000 U/mL时反而会抑制细胞的增殖[13]。

5.2 表皮细胞生长因子在细胞培养中的应用

目前表皮生长因子多用于临床，体外培养表皮细胞覆盖烧烫伤创面，对成纤维细胞、角质形成细胞以及癌前病变的细胞、肿瘤细胞等具有促增生的作用。可以通过向无血清的培养基中添加生长因子的方法精细研究生长因子在细胞培养中的作用[14]，结果显示表皮生长因子可以促进表皮细胞的增殖、细胞生长和分化。正常的表皮细胞角质化死亡是一种特异类型的生理性细胞凋亡，但是表皮细胞凋亡也可由环境因素诱导发生，如低温、热休克、紫外线、射线，超氧化物、干扰素及细胞毒等都具有触发凋亡的作用。细胞的过度或持续凋亡会造成细胞染色体结构破坏、DNA损伤与突变、基因稳定性丧失、基因表达模式的改变，表现出细胞增殖和生长的抑制。实验证明在表皮生长因子存在的情况下，凋亡的发生率很低，细胞生长健壮并具有分裂的形态特征，反之，细胞则表现为典型的凋亡形态[15]。

不同浓度的表皮生长因子对细胞增殖的促进作用不同，在一定浓度范围内，随着表皮生长因子浓度的增加，其对细胞的促增生作用也不断增强，超过此范围后，随着其浓度的增加这种促增生作用有所下降，甚至会产生抑制效应。这可能与表皮生长因子的受体消耗以及细胞自身的负反馈有关，效浓度的重要性，否则过度的使用该因子会产生负面的效果，影响临床效果[8]。细胞的增殖和生长对于生长因子浓度不尽相同，如在角膜上皮细胞进行传代是要求的浓度为10 ng/mL[16]，在培养人角质细胞增殖是最适浓度为0.1-1 ng/mL[8]，在传代培养的大鼠生长板软骨细胞时最适浓度为1 ng/mL[7]。

5.3 成纤维细胞生长因子在细胞培养中的应用

FGF是一种多功能的肝素结合的蛋白质，但是这种多功能作用多与神经系统有关，它可以协同其它神经营养因子作用，促进神经系统和感觉系统细胞的生长[17]。FGF可以促进细胞的增殖，加快细胞倍增，尤其能缩短细胞周期的G1期的时间。FGF对中胚层来源细胞是一个强有力的致分裂源。同时，它可以稳定细胞的表现型、促进细胞的定向分化并且有明显的延缓细胞老化、促进伤口愈合和血管生成的作用[18]。人和小鼠的FGF6基因以及它的产物可以促进肌肉细胞的生长[19]。

近几年FGF在细胞培养中的应用主要有：bFGF在浓度为10～100 ng/ml时对小鼠和兔的胚胎脊髓神经细胞的生长和发育有明显的促进作用，但是当bFGF的浓度为200 ng/ml时则会抑制细胞的生长和发育，细胞的存活率明显下降[20，21]；aFGF对体外培养的大鼠肾小管上皮细胞有明显的促生长和增殖作用，在浓度为0.45 mg/L时可以看到细胞数量明显增多，促增殖作用明显[22]。

6 生长因子在细胞培养中应用的前景展望

由于体外培养的细胞在研究起来较成体研究有很大的优势，主要表现在经济性和方便性，可以弥补成体缺乏等一系列的缺点。目前细胞培养的技术已广泛的应用于生物学的各个领域，如细胞生物学、分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学等研究。因此对所培养细胞的质量和数量就有较高的要求。各种生长因子的加入使这一要求变得简单，近几年越来越多的研究者置身于研究生长因子在细胞培养中的作用，包括浓度以及培养时间对于所培养细胞的影响。对于一些不好培养但是又有重要研究价值的细胞系，加入生长因子无不是一种可行的方法。例如在研究一些稀缺物种时，由于数量有限采用成体作为研究对象是不可行的，只有培养出该物种可以传代的细胞系，以细胞系作为研究对象，才能进行更加深入的研究，保护物种继续生存。同时内源生长因子较外源生长因子也有很大的优势，因为内源生长因子是直接由培养的细胞来调控生成生长因子的数量和种类，更能够促进细胞的增殖，避免其他不必要因素的干扰。随着生物研究的不断深入各学科之间的交叉也越来越多，各种不同的实验技术也相继产生，生长因子在细胞培养中的应用也将不断发展，并逐渐应用到生物学的不同领域中去。

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