APP下载

抗菌肽分子设计研究进展

2010-04-13宋雪莹冯兴军

饲料博览 2010年9期
关键词:抗菌肽残基多肽

宋雪莹,冯兴军,李 静

(东北农业大学动物营养研究所,哈尔滨150030)

抗菌肽在自然界中分布广泛,种类繁多,已相继从细菌、真菌、两栖类、高等植物、哺乳动物以及人类中发现并分离获得[1-2]。与普通抗生素相比,抗菌肽的抗菌谱广,相对分子质量小,热稳定性好,无免疫原性,不易产生耐药性,对真核细胞几乎没有作用,只对原核细胞和发生病变的真核细胞有作用,但活性不够理想,成为影响抗菌肽应用的限制因素之一。研究抗菌肽构效关系,通过分子设计与改造进一步提高抗菌肽的活性成为目前该领域的研究热点。本文综述了近年来抗菌肽分子设计的最新进展与成果,为相关领域的研究提供理论依据。

1 抗菌肽分子设计的主要原则

抗菌肽作为一种多肽序列,由氨基酸组成,生物学活性与多肽分子的多种结构参数密切相关,包括多肽分子的等电点、静电荷、疏水性、亲水性、二硫键及其氨基酸序列、α-螺旋等参数。

1.1 含有α-螺旋结构的线性抗菌肽

目前大部分抗菌肽的结构功能研究以及分子设计主要集中于两亲α-螺旋抗菌肽。α-螺旋抗菌肽分布最广,数量最多,并具有广谱抗性;该类抗菌肽长度短,易于化学合成;线性结构简单,易于通过圆二色谱分析和多维核磁共振进行结构测定[3]。

α-螺旋在抗菌肽发挥抗菌作用的过程中具有重要作用。α螺旋是破坏、裂解细菌的主要结构,当抗菌肽结合到细菌细胞膜上时,α螺旋相互聚集使细胞膜形成孔洞,细胞质外溢而致细菌死亡[4-6]。经1H NMR分析表明,当用Ala替换抗菌肽分子中的Pro残基后,其二级结构由伸展状转变成为螺旋状,导致其膜插入程度的增加和跨膜迁移能力的提高,更容易进入细胞质及胞质靶位点[7]。

有研究认为,N-端的α-螺旋结构域很重要,足以维持抗菌活性[8]。目前仍未研究出抗菌肽螺旋度与抗菌活性的定量关系。主要原因是由于抗菌肽的活性受多种因素决定。氨基酸替换除改变螺旋度外,同时也导致其他结构参数的改变,如疏水力矩、疏水性、极性和非极性结构域的大小以及电荷数和电荷分布等[9-10]。

1.2 特殊残基对抗菌活性的影响

在抗菌肽天然结构中有部分氨基酸被另一种氨基酸取代,可改变抗菌肽的杀菌能力。在保留两亲螺旋结构的前提下进行单残基突变,用甘氨酸取代抗菌肽Ovispirin-1第10位的异亮氨酸,结果克服了对红细胞的溶血性,并提高了抗菌活性[11]。人工合成了[A6]-IsCT多肽,与天然抗菌肽IsCT相比,第6个氨基酸残基Trp被Ala所替换。被替换后的[A6]-IsCT几乎无抗菌活性[12]。类似的研究发现,用Leu取代Pro可使人工合成的抗菌肽P18的活性下降 2 倍[13]。

1.3 抗菌肽的阳离子性

抗菌肽的阳离子性与抗菌肽的抗菌机制有关,由于细胞膜外带有负电荷,所以呈阳离子性的抗菌肽易与其结合并通过细胞膜,从而使病原细胞瓦解。此外,在不同的pH下,氨基酸带有不同的电荷,如在中性或偏酸性条件下,Lys和Arg都带正电荷,所以含Lys和Arg受pH变化影响较小;富含His的抗菌肽受pH变化影响较大[14]。因此增加带正电氨基酸的数量,或改变其在肽链中的位置,均可影响抗菌肽的二级结构,从而进一步影响其抗菌活性。

1.4 抗菌肽C端酰胺化和N端无多余的残基对抗菌活性的影响

抗菌肽C端酰胺化和N端无多余的残基都将增加抗菌肽的抗菌活性。由于C端酰胺化可引起多肽静电荷的增加,使得进入靶细胞的能力增加,抗菌能力加强。N端插入细胞膜是抗菌肽杀死细胞的必需条件,N端含有多余的残基将增加N端的柔韧性和摆动性,若破坏两亲结构的形成和稳定,造成N端难以插入细胞膜,将导致活性降低。对人工合成的抗菌肽P18逐一去除N-端和C-端氨基酸残基,发现随着末端残基的去除,其抗菌活性成倍下降。

1.5 抗菌肽的亲水性和疏水性

抗菌肽活性是亲水基团和疏水基团相互作用的结果。疏水作用对其活性的影响是通过改变肽链中Leu、Ile、Val数量实现的。增加疏水性氨基酸能够增加抗菌肽形成两性α-螺旋的能力,而α-螺旋的增加也提高了抗菌肽的稳定性。但是增加分子的疏水性,抗菌肽的抗菌活力和对哺乳类动物细胞的溶血活性同时增加,这是由于疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用。肽链疏水面的正电荷可能对抗菌肽的溶血活性有重要影响。研究发现,Melittin抗菌活性和溶血性随着疏水力矩降低而减弱,直至消失[15]。也有报道,平均疏水力矩的变化比疏水性和螺旋度的变化对抗菌活性的影响更大[16]。

2 抗菌肽分子设计的方法

2.1 以天然抗菌肽为模板设计合成类似物

根据天然抗菌肽,以其为设计模板,在一个或多个序列位置上氨基酸残基发生改变,或改变肽链长度,设计合成新的抗菌肽。该方法涉及到在活性中起重要作用的氨基酸残基或结构域。利用这种方法获得许多的类似物已被设计合成并用于抗菌肽构效关系研究。

2.2 杂合肽的设计

根据GenBank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列,串联后人工合成了融合基因Bac7-Bac5片段,克隆于原核表达载体pET32中,构建了重组表达载体pET-B7-B5,将其转化于E.coliBL21中,实现了重组蛋白B7-B5(rB7-B5)的过表达,B7-B5表达量约占细菌总蛋白的36.6%,对猪胸膜肺炎放线杆菌和耐药性大肠杆菌具有很好的抑菌活性[17]。将 cecropinA(1-8)和 magainin2(1-12)串联起来,构建至含有人泛素融合蛋白 pQE30重组表达质粒上,在大肠杆菌M15中得到了高效异源表达[18]。

2.3 氨基酸残基替换

改变抗菌肽的某个氨基酸残基可影响抗菌肽的活性,且该方法在克服抗菌肽毒性问题上有理想的效果。在研究LfcinB时,进行单残基突变,用丙氨酸取代抗菌肽LfcinB第6位和第8位的色氨酸,结果发现其中任何一个色氨酸被取代,都会造成抗菌肽失去抗菌活性[19]。

2.4 截取天然抗菌肽的部分序列

人工合成的多肽MCF,由Melittin的C端15个氨基酸残基组成,MCF包含了Melittin的大部分两亲片段,抗菌活性比Melittin高5~7倍,而溶血活性低300倍。MCF的类似物MCFA是两个阳离子残基从C端转到N端形成的,与Melittin的抗菌活性相当,但溶血活性仅比MCF高一点。说明抗菌肽的生物物理学特性与其生物学活性密切相关[20]。

3 抗菌肽分子设计的主要步骤

选择天然活性相对较高的作为母本抗菌肽,结合结构参数,进行分子设计,设计系列抗菌肽分子衍生物;通过多肽分析软件对设计抗菌肽分子衍生物分析,对其进行优化;通过软件分析优化后,选出结构参数理想、具有高活性潜力的新型抗菌肽分子,对其进行化学合成;检测化学合成抗菌肽的活性,进一步验证筛选;测定筛选的具有理想活性的新型抗菌肽结构,探讨抗菌肽结构与活性的关系,在获得新型抗菌肽的同时,进一步完善抗菌肽构效关系和分子设计的理论基础。

4 展望

抗菌肽具有很多优点,但依然存在一定问题。抗菌肽较其他抗菌药物相比活性较低,所以通过改变抗菌肽结构的方式提高活性。但有时在提高抗菌活性的同时也一定程度的提高了细胞溶血性。综合利用改变抗菌肽活性参数,设计需高活性,低溶血性的抗菌肽仍是需要继续研究的问题。

[1] He J,Anderson M,ShiW,et al.Design and activity of a dualtargeted antimicrobial peptide[J].International Journal of Antimicrobial Agents,2009,33(6):532-537.

[2] Urban E,Nagy E,Pal T,et al.Activities of four frog skin-derived antimicrobial peptides(temporin-1DRa,temporin-1Va and themelittin-related peptides AR-23 and RV-23)against anaerobic bacteria[J].International Journal of Antimicrobial Agents,2007,29(3):317-321.

[3] Giangaspero A,Sandri L,Tossi A.Amphipathic alpha helical an timicrobial peptides[J].Eur J Biochem,2001,268(21):5 589-5 600.

[4] 张宗梁,姚鑫.Toll受体介导的天然免疫信号传递系统:从果蝇到人类[J].上海免疫学杂志,1998,18(6):321-324.

[5] Bals R.Epithelial antimicrobial peptides in host defense against infection[J].Respir Res,2000,1(3):141-150.

[6] Lemaitre B,Reichhart JM,Hoffmann JA.Drosophila host defense:Differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes ofmicroorganisms[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(26):14 614-14 619.

[7] Zhang L J,Rozek A,Hancock R EW.Interaction of cationic antimicrobial peptides with model membranes[J].J Biol Chem,2001,276(8):35 714-35 722.

[8] Mor A,Nicolas P.The NH2-terminalalpha-helicaldomain 1-18 of dermaseptin is responsible for antimicrobial activity[J].J Biol Chem,1994,269(3):1 934-1 939.

[9] Dathe M,Wieprecht T.Structural features of helical antimicrobial pep tides:their potential tomodulate activity on modelmem branes and biological cells[J].Biochimicaet Biophysica Acta,1999,1 462(1-2):71-87.

[10] Wieprechta T,Dathea M,Nikolenkoa H,et al.Hydrophobicity,hydrophobic moment and angle subtended by charged residues modulate antibacterial and haemolytic activity of amphipathic helical peptides[J].FEBS Lett,1997,403(2):208-212.

[11] Sawai M V,Waring A J,Kearney W R,et al.Impact of single residuemutations on the structure and function of ovi spirin pnovispirin antimicrobial peptides[J].Protein Eng,2002,15(3):225-232.

[12] Lee K,Shin SY,Kim K,et al.Antibiotic activity and structural analysis of the scorpion-derived antimicrobial peptide IsCT and its analogs[J].Bioche Biophy Res Comm,2004,323(2):712-719.

[13] Shin S Y,Kang SW,Lee D G,et al.CRAMP analogues having potentantibiotic activity againstbacterial,fungal,and tumor cells without hemolytic activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,275:904-909.

[14] Chan D I,Prenner E J,Vogel H J.Tryptophan and arginine-rich antimicrobial peptides:Structures and mechanisms of action[J].Biochim Biophy′s Acta,2006,1 758(9):1 184-1 202.

[15] Pathak N,Salas-Auvert R,Ruche G,et al.Comparison of the effects of hydrophobicity,amphiphilicity,and alpha-helicity on the activities of antimicrobial peptides[J].Proteins,1995,22(2):182-186.

[16] Perez-Paya E,Houghten R A,Blondelle SE.The role of amphipathicity in the folding,self-association and biological activity of multiple subunit smallproteins[J].J Biol Chem,1995,270(3):1 048-1 056.

[17] 赵昆,刘思国,王春来,等.牛抗菌肽Bac7-Bac5融合基因在大肠杆菌中的过表达、纯化及抑茵活性[J].中国生物工程杂志,2007,27(3):65-70.

[18] Xu X,Jin F,Yu X,et al.High-level expression of the recombinant hybrid peptide cecropinA(1-8)-magainin2(1-12) with an ubiquitin fusion partner in Escherichia coli[J].Protein Expression and Purification,2007,55(1):175-182.

[19] 李桂平,陈仪本.一种新融合抗菌肽Hex-Mag基因的克隆表达及其抗菌活性的研究[J].微生物学报,2007,47(1):115-120.

[20] Subbalakshmi C,Nagaraj R,Sitaram N.Biological activities of C-terminal 15-residue synthetic fragment of melittin:design of an analog with improved antibacterial activity[J].FEBS Lett,1999,448(1):62-66.

猜你喜欢

抗菌肽残基多肽
基于各向异性网络模型研究δ阿片受体的动力学与关键残基*
抗菌肽的生物学特性及在畜禽养殖中的应用
“残基片段和排列组合法”在书写限制条件的同分异构体中的应用
高多肽含量苦瓜新品种“多肽3号”的选育
新型抗菌肽菌丝霉素纯化工艺研究
抗HPV18 E6多肽单克隆抗体的制备及鉴定
抗菌肽修饰方法与抗菌机制的研究进展
蛋白质二级结构序列与残基种类间关联的分析
基于支持向量机的蛋白质相互作用界面热点残基预测
胎盘多肽超剂量应用致严重不良事件1例