MMP-9抑制剂巴马司他对体外循环犬肺组织中 iNOS表达的影响

冯俊波,葛圣林*,龚文辉,张成鑫

(1安徽医科大学第一附属医院,合肥 230022；2安徽医科大学第二附属医院)

体外循环(CPB)过程中,缺血再灌注(IR)可致急性肺损伤。实验表明,IR时肺组织中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)活性增强[1],导致生成大量的 NO,与超氧阴离子结合后,使过氧化亚硝酸堆积,加重肺组织损伤。基质金属蛋白酶 9(MMP-9)能降解肺毛细血管基底膜中的细胞外基质(ECM)成分,使肺毛细血管通透性增加和炎性细胞进一步浸润[2]。2008年 3月 ～2009年 3月,我们观察了外源性 MMP-9抑制剂巴马司他对犬体外循环肺组织中 iNOS表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 16只出生半年左右的健康杂种幼犬(体质量 10～12 kg),MMP-9 ELISA试剂盒,巴马司他,戊巴比妥钠,iNOS试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与 CPB模型的建立 将幼犬随机分为对照组和实验组,各 8例。两组均建立 CPB模型:戊巴比妥钠 30 mg/kg静注,22 G留置针插犬右下肢动脉测动脉血压及备取血样用,22 G留置针插犬左下肢静脉备输液及备取血样用；行气管插管,机械通气,辅助呼吸。FiO2100%,潮气量 15 ml/kg,频率 15～18次/min。前正中切口,静脉给予肝素 600 U/kg,检测激活凝血时间(ACT)＞480 s。升主动脉插管(4 mm),上下腔插管(36 Fr),经肺动脉插入10F动脉灌注管,左房放置 18F静脉引流管。心肌保护采用改良 St.Thomas液 10 ml/kg,每 30 min灌注 1次。降温,泵流量 50～80 ml/(kg◦ min)转流,建立 CPB模型。CPB 60 min后开放主动脉,心脏复跳,恢复肺动脉血供,维持循环稳定,并持续呼吸机辅助通气,90 min撤离 CPB。于术后 3 h 10%KCl处死实验犬。

1.2.2 巴马司他应用方法 实验组在升主动脉阻断后,用含巴马司他 30 mg/kg的肺保护液(654-2、NaHCO3等,渗透压为 350 Osm)持续灌注肺动脉,流量为 30 ml/(kg◦min),开放升主动脉后停止灌注。对照组灌注不含巴马司他的肺动脉保护液,方法同实验组。

1.2.3 犬肺组织病理观察 CPB结束后,取左上肺标本,用 4%多聚甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察肺组织病理形态变化。同时,另取左上肺标本,用戊二醛迅速固定,切割成1 mm3大小的 6块。戊二醛固定、漂洗、锇酸固定、包埋、聚合、切片,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色,用Jeol JEM-1230透射电镜观察形态学改变。

1.2.4 犬肺组织中 iNOS检测方法 取肺组织块 1 g,放入预冷的缓冲液 9 ml中,用匀浆器制成 10%的肺组织匀浆。取肺组织匀浆 4℃ 3 000 r/min离心15 min,取上清液,按 iNOS试剂盒说明书应用酶谱仪测量标准物及各个样品的光密度(OD值)。以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,用标准物的浓度与 OD值计算出标准曲线的直线回归方程式。将样品的 OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即测量出各样品中 iNOS水平。

1.2.5 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件。应用 Levene检验对各组数据间进行方差齐性检验,两组间比较应用 LSD-t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组犬肺组织病理变化 光镜下,实验组肺泡结构较完整,肺泡腔清晰,炎症改变相对较轻,水肿及出血减少；对照组肺泡壁弥漫性渗出水肿,毛细血管扩张充血,肺泡壁和肺间质内可见大量白细胞浸润以及肺泡结构破坏。电镜下,对照组肺泡Ⅱ型上皮细胞基底膜变薄,细胞游离面微绒毛消失,线粒体肿胀破裂,嵴紊乱消失,多数板层小体排空,形成较大空泡；实验组肺泡Ⅱ型上皮细胞形态较对照组明显好转,细胞游离面微绒毛有序排列,线粒体轻度肿胀,嵴排列稍紊乱,板层小体空泡化较对照组明显减轻。

2.2 两组犬肺组织中 iNOS水平比较 实验组犬肺组织中 iNOS为(1.69±0.32)U/mg prot,明显低于对照组的(2.25±0.43)U/mg prot,P＜0.05。

3 讨论

CPB后肺损伤发生的具体机制尚未完全清楚,但中性粒细胞释放的血浆蛋白酶如基质金属蛋白酶(MMPs)已被认为与 CPB引起的急性肺损伤和ARDS密切相关[3]。MMP-9是 MMPs家族中一种依赖锌离子的金属蛋白酶,参与 ECM的降解和重建,并可作为中性粒细胞的趋化因子,引起中性粒细胞聚集。MMP-9可降解由Ⅳ型胶原等组成毛细血管和肺泡上皮的基膜,导致肺毛细血管通透性增加,使富含蛋白的血浆进入肺泡,发生肺水肿、肺内分流增加、低氧血症等,最终导致急性肺损伤甚至 ARDS。近年来,越来越多研究证实 MMP-9在 CPB后循环中明显增加[4],且与急性肺损伤明显相关。金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是一种内源性 MMPs抑制剂,可以抑制所有的 MMPs。TIMPs与 MMPs之间的平衡是 ECM维持完整的前提条件。在急性肺损伤过程中存在 TIMPs和 MMPs的失衡,应用 TIMPs可减轻肺损伤程度。巴马司他是 MMPs的外源性特异性抑制剂,其首先作为抗肿瘤尤其是抗肿瘤转移药物被开发应用的,且动物的急性和长期毒性实验表明无明显毒性。鉴于 MMP-9在 CPB急性肺损伤发病中的重要作用,我们认为 MMPs抑制剂可能在CPB急性肺损伤的治疗中发挥重要作用。

一氧化氮合酶(NOS)的主要功能是催化 L-精氨酸生成 NO。NO作为一种重要的信使分子,具有维持细胞内环境稳定和保护细胞的作用。NO能舒张平滑肌(选择性扩张肺血管,调节气道平滑肌的张力),抑制炎症介质释放(抑制白细胞黏附及趋化,抑制血小板黏附及聚集等),从而降低肺血管阻力(PVR),减少肺内分流,改善供肺的氧合,但大量NO对机体有氧化损伤和致炎症作用。目前发现并定名的人体内NOS有3种,Ⅰ型主要存在脑和神经细胞的细胞质内,称为脑型(bNOS)或神经型(nNOS)；Ⅲ型主要存在于血管内皮细胞的细胞膜上,称为内皮型(eNOS)；Ⅰ型和Ⅲ型又统称构成型(cNOS),是许多正常组织中正常存在的一种酶。其合成的 NO在维持神经细胞的效应传递功能和血管的舒缩功能等方面有重要作用。Ⅱ型称为 iNOS,存在于巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、内皮细胞等细胞中,只在细胞受到刺激被激活后才表达。其生成 NO的量比 cNOS高出上千倍,能持续产生 NO数日[5]。

研究发现,iNOS与 IR损伤密切相关。文献报道,离体肺 IR损伤后,eNOSmRNA表达降低,而 iNOSmRNA表达增高[6]。有实验表明,肺损伤时肺组织中的 NO主要来源于 iNOS,而 eNOS的作用很小[7]。iNOS的生成增加可产生大量的NO,NO能破坏细胞代谢、损伤 DNA引起细胞死亡；并能直接损伤组织,促进吞噬细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF),继而增加细胞因子介导的组织损伤。大量生成的 NO可与氧自由基结合,生成毒性更强的过氧亚硝酸离子。有文献报道,iNOS本身也具有氧自由基生成活性,能诱导 O-2的生成[8]。曹华等[9]实验证实,再灌注肺组织中 eNOS表达下调,iNOS在肺泡上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞的表达明显增强。胡静等[10]研究表明,应用 iNOS抑制剂氨基胍,能明显减轻博莱霉素引起的肺损伤。

我们采用外源性 MMP-9抑制剂巴马司他进行犬 CPB模型的肺动脉灌注,常规病理及电镜显示实验组肺损伤程度较对照组明显减轻,实验组肺组织iNOS表达量低于对照组,提示应用巴马司他进行肺动脉灌注,能减轻 CPB中的肺损伤,减少肺组织中iNOS的产生。其原因可能是缺血状态下 eNOS表达下调,NO合成减少,加剧了血小板聚集,白细胞黏附,产生大量 TNF、IL-21、IL-28等细胞因子和内毒素,诱导肺内 iNOS表达增强[11]。而巴马司他能抑制 MMP-9引起中性粒细胞聚集,减少了 TNF、IL-21、IL-28等细胞因子的产生,从而减少了肺组织内iNOS的生成。

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