转基因作物安全性及外源基因加工降解研究进展

朱占齐 王卫国

1 转基因作物发展概况

转基因作物的研究始于20世纪80年代初期。1996年，美国最早开始大规模商业化生产和销售转基因作物(包括大豆、玉米、油菜、土豆和西红柿)，当年世界转基因作物种植总面积为170万公顷。据国际农业生物技术应用推广站(ISAAA)信息，截止2008年底，全球转基因作物种植面积连续13年持续增长，年种植面积增加了72.5倍，即从0.017亿公顷增长至1.250亿公顷，较2007年（种植面积1.143亿公顷），同比增长9.4%，占全球作物种植总面积（15亿公顷）的8%。如果把使用多种转基因技术的作物计算在内，涉及转基因技术的作物种植面积（性状种植面积）达到1.66亿公顷，全球转基因作物累计种植面积达到8亿公顷。

1996年至2008年，全球转基因作物种植国家从6个增加到25个，其中发展中国家15个，发达国家10个。其中有10个国家种植了复合性状转基因作物。种植面积超过100万公顷的有8个国家，中国排第6名，种植面积达到380万公顷，中国种植的转基因作物包括棉花、番茄、杨树、牵牛花、抗病毒木瓜和甜椒。农业部2009年已颁发了两种转基因水稻和一种转基因玉米的生物安全证书。

随着转基因技术的应用和推广，越来越多的国家和地区采纳转基因技术进行商业化生产，转基因作物的市场价值逐年增长。1996年转基因作物全球市场价值为2.35亿美元，到2008年激增到84亿美元。据ISAAA2008年度报告显示，自转基因作物大面积商业化种植的13年以来，全球转基因作物市场价值累计为440亿美元。转基因作物全球市场价值是根据Bt种子销售价加上所有适用技术之费用进行计算的。专家预计2015年全球转基因作物的潜在收益将达到2100亿美元。可见，转基因商业化生产能够带来巨大的经济利益和其广阔的前景。

转基因作物的外源基因可分为三大类:第一类是辅助转化基因，包括报告基因和抗生素抗性基因等;第二类为改良植物性状的目的基因，如抗病毒、抗虫、抗除草剂和品质、性状、育性改变基因等;第三类为调控目的基因表达的序列，如启动子、终止子和增强子序列等。这类转基因作物主要具有抗除草剂性、抗病性和抗虫性，称为“输入性状”，转入基因的功能是改良农艺性状，得益的是农民和开发商。在商业化种植的转基因作物中，抗除草剂一直是其最主要的特性，其次是抗虫性，再次是混合型特性（抗虫和耐除草剂等）。2008年，混合型特性品种的种植面积超过抗虫性品种，这表明多种特性的转基因作物将成为未来发展的重点。随着生物技术的不断发展，第二代转基因作物将不断开发“输出性状”，重点在改良品质，增加营养，或使食品具有医疗保健功能，或用作环保和工业原料，从而大幅度增加农副产品的附加值，并使消费者直接得益，如富含维生素A的金米稻，高赖氨酸或高油玉米，高油酸大豆，以及生产可降解塑料等的转基因植物等。

随着转基因技术的快速发展以及转基因产品在国际贸易中带来的巨大商业利益，转基因生物安全问题成为世界关注的热点，引起了政府间、学术界的争论。转基因作物对人类、动植物、微生物和生态环境构成的危险或潜在的风险，主要涉及环境安全和食品安全。

2 国内外对转基因作物所持态度

基于对转基因作物生物安全的关注，一些国际性组织及各个国家都纷纷采取行动，制定了相应的管理措施。经济与合作组织 (OECD)、联合国粮农组织（FAO）、世界卫生组织(WHO)、联合国开发署(UNDP)、联合国环境规划署(UNEP)、国际生命科学学会(ILSI)都积极地参与生物技术的安全性管理和国际协调工作。制定和提出了相应的风险管理法规、规则和办法，以规避可能的健康和环境风险。许多国家都制定了详细而严格的生物安全管理方面法规和政策，以规范转基因作物的研究、开发、田间试验、环境释放、商业化生产的整个过程。并对涉及转基因技术及其产品相关的国际贸易、知识产权、标签政策等方面的问题给予了关注。

欧洲是最早为转基因食品采取标识制度的地区，从1997年开始，欧盟要求各成员国监管食物销售(特别针对各类转基因或含转基因成分食物)及实行标识制度，并且要求越来越严格，2001规定凡含有0.9%以上转基因DNA或蛋白质的农作物或食品，在市场销售时，必须带有“GMO”(转基因)字样的标签。2002年7月，要求在不考虑含量多少的情况下，对所有含转基因成分的农作物或食品都进行明确标识。此外，欧洲议会还建议加强对转基因污染事故的通报制度。2010年3月2日，欧盟委员会则首次批准商业种植由德国化工企业研制的转基因土豆。尽管这一裁决依然充满争议，但却被认为是欧盟委员会对转基因农作物立场的转变，意义特殊。此前，仅有少量转基因玉米在欧盟成员国内种植。

进入21世纪，亚洲各国也制定了适合本国国情的转基因作物管理制度，要求将转基因食品纳入监管，所有转基因食物必须贴标签，并且规定必须注明转基因成分，所有转基因食品必须经过安全检验。有些国家设立了GMO标签法。在加强管理的前提下，部分国家也分别制定颁布了本国的基因工程法律或准则。2000年4月，日本曾禁止进口美国转基因大豆，2009年10月，印度政府下属的基因工程批准委员会批准了转基因茄子的商业种植。此后，反对声不断。2010年2月9日，印度环境部长拉梅什宣布，禁止商业种植转基因茄子。

我国对转基因产品采取积极而谨慎的态度，一方面充分肯定转基因作物对于促进发展中国家的农业发展和解决粮食问题的重要性，并积极支持转基因技术的研究和应用；另一方面对转基因作物的研究开发和应用实行严格的安全审查和管理制度。自1993年以来，也陆续出台了一系列相关的政策和法规，以加强对转基因技术及其产品的安全性管理，尊重消费者的知情权和自由选择权。目前我国转基因食品法规主要有：1993年国家科委颁布《基因工程安全管理办法》、2001年5月9日实施《农业转基因生物安全管理条例》、2002年3月20日起实施《农业转基因生物安全评估管理办法》，第一次将转基因从低到高分为4个等级。2002年3月20日起实施《农业转基因生物标识管理办法》，规定对转基因产品实施标识制度。2002年4月8日颁布，7月1日起实施《转基因食品卫生管理办法》，2004年6月12日颁布《进出境转基因产品检验检疫管理办法》。

转基因作物的标识管理制度的建立，对于保持生态环境、确保人类健康和动植物安全、保护消费者的知情权和选择权具有重要意义。

3 转基因作物安全性问题

目前，有关转基因作物对环境可能产生的影响主要有以下几方面：转基因作物或其亲缘野生种可能变为杂草；转基因作物可能产生新的病毒疾病，使目标害虫产生抗性；非目标生物受到危害、破坏生物多样性、影响生态系统。

转基因作物或其亲缘野种可能变为杂草，而破坏生态平衡。部分栽培作物，当被插入一个如抗病、抗虫基因时，如果其外源逃逸，可能会使其作物自身的稳定性发生改变，而趋向于杂草化。转基因作物对非目标生物的伤害，可能会影响生物的多样性。Losey等（1999）和Birch等（1996）研究表明，大规模种植抗虫转基因作物会使昆虫种群减少，进而影响生物的多样性。除草剂的过量施用还可能造成一些非主要作物受到伤害甚至灭绝，从而引发链式反应，昆虫、鸟类、哺乳动物最终成为受害者。

研究表明，转基因棉花Bt基因流在陆地棉品种间以及陆地棉和海岛棉间发生了转移。一些抗病毒基因逃逸到其他土壤微生物也可能产生新的致病性病毒。而且由于导入外源目的基因，转基因作物已经突破了传统的界、门概念，具有普通物种不具备的优势特征。作为外来品种进入自然生态系统，往往具有较强的“选择优势”，可能会影响植物基因库的遗传结构，导致野生等位基因的丢失而淘汰原来栖息地上的物种和其它遗传资源，乃至影响农业生态系统中有益天敌生物的种类和种群数量，使生物多样性丧失。

对于转基因食品安全性，争论的热点包括:①转基因作物中的外源基因是否可能引起动物和人的过敏反应；②抗虫转基因作物产品中的杀虫蛋白、蛋白酶活性抑制剂和残留的抗昆虫内毒素是否会危害人和动物的健康；③抗病毒转基因作物中导入的病毒外壳蛋白基因可能对人和动物的健康产生危害；④抗除草剂转基因作物的推广可能导致除草剂在环境中残留量增高进而污染食品和饲料；⑤转基因作物中的抗性基因是否会转移；⑥饲喂转基因饲料的动物产品(肉、蛋、乳等)是否安全；⑦转基因食品营养品质的改变是否对人体健康不利。

当目的基因的产物如果是潜在的过敏原，则该转基因食品有可能引起人体的过敏反应。在对转基因食品进行安全性评价时，过敏诱发性是个相当重要的因素。在已被批准商业化生产的转基因植物食品中，外源基因编码蛋白的过敏性均已经过相关审查。如Nebraska大学食品科技系证明，表达巴西坚果2 S清蛋白的大豆有过敏性，这是迄今已知转基因植物未被批准商业化的例子。若转基因食品中含对部分人群有过敏性反应的蛋白，则需加标签，以使购买者做出选择。

一些人认为，转基因食品中存在一些具有抗生素抗性的标记基因，有可能在动物肠道中转移给微生物，食用这些产品可能会使饲养动物和人体具有抗生素抗性，从而影响抗生素治疗的效果。但也有人认为，食物中的基因转移到肠道微生物的可能性极小，而食物中的遗传物质也不会转移到人体中。

转基因产品的目的基因可能带来的另一不安全因素是可能引起食品的营养成分或品质发生改变，甚至产生一些抗营养因子，对人体健康产生不良影响。另外，转基因产品的目的基因在表达时，可能会促使一些天然毒素的表达率提高，如豆科蛋白酶抑制剂、马铃薯的茄碱等，也会带来不利影响。

美国食品及药物管理局(FDA)明确提出，转基因作物的DNA片段很可能会被哺乳动物细胞摄入。英国官方则指出，转基因的DNA不但可通过摄食转移，而且可在食品加工和农场工作时通过接触粉尘、花粉转移。2004年6月，德国研究人员首次在用转基因饲料喂养的奶牛产出的奶中，发现了转基因作物的DNA片断。美国研究机构进行了20多项转基因饲料对畜禽的试验，未发现转基因饲料对畜禽的生长性能、健康状况及肉、蛋、奶组分产生影响，在肉、蛋、奶中也未检出转基因蛋白和转基因DNA。可见关于这个问题，并无定论。

转基因食品经过不同的加工程序，转基因的DNA片段将发生不同程度的降解和断裂（陈颖等，2005），从而直接影响到最初的转基因成分在最终产品中的含量和作用，所以在分析评估转基因食品安全问题的时候应该充分考虑到食品实际加工过程，同时还应考虑最终到消费者消化道中的转基因片段在人体内的反应等因素。转基因食品（饲料）的安全性目前仍存在争议，需要长时间观察才能得出结论。

4 转基因作物外源基因加工降解研究进展

国内外关于转基因作物外源基因加工降解定性研究的报道目前已有许多，总结归纳如下：外源目的基因相对于内源基因来说基因片段较少，在高温、高压、酸碱处理、酶解、发酵和剪切力等物理、化学及生物变化影响下,会随着基因组DNA的降解而降解（金红等，2003）。王卫国等（2004）认为，不同饲料加工方法对饲料DNA的降解作用不同。粉碎、配料、混合、普通制粒工艺、青贮不能有效降解饲料DNA。而充足时间的高温、高压加工可有效降解饲料DNA。Chiter等(2000)对饲料中的一些植物性原料，如榨油前及榨油后的油菜、亚麻籽、大豆、小麦粉、新鲜的玉米粉和玉米粒、甜菜及甜菜浆中DNA的稳定性进行了研究。结果表明，高温和高压蒸汽可降解小麦和玉米粉中的基因组DNA和Rubisco SS基因。

Sarah R.Murray等(2007)使用实时荧光PCR技术对玉米内源基因 (叶绿体的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因及细胞壁转化酶基因)在蒸煮、挤压时的含量变化进行了研究,结果发现，当玉米粉在100℃下蒸煮60 min以后,DNA含量骤然下降,特别是细胞壁转化酶基因。对玉米渣进行挤压试验时,当设定温度60℃时DNA变化不明显,而当设定温度170℃时DNA显著减少。当设定扭矩6 nm时,挤压温度170℃时与挤压温度60℃时相比，小片段的DNA含量明显减少。扭矩36 nm的情况下,3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的68 bp片段和细胞壁转化酶基因的97 bp片段几乎不能检测出来,该研究表明,温度和机械力都对DNA降解有影响,更重要的是温度和机械力的复合作用是正向加强的。

Bauer(2003)研究了加工温度、pH值对食品中DNA降解的影响。用高效液相色谱（HPLC）法能够定量鉴别闭环的和刻痕的质粒DNA，在缓冲液中质粒DNA的刻痕随pH值的降低而显著增强。事实上，在番茄浆液中也观察到了相同的降解率。温度和pH值的复合作用是正向加强的。对于在缓冲液中的转基因玉米DNA达957 bp的片段在处理时间≤90 min、65℃、pH值4.0的条件下仍可检测出。Gawienowski等（1999）研究表明，经浸泡、湿磨等加工过程能使玉米基因和质粒DNA降解，135℃加热2 h后，DNA几乎完全降解。而Kharazmi等（2003）认为，浸泡后又经过物理破碎处理而做成的豆奶、豆腐和热加工做成的玉米糊和马铃薯，没有检测出大于1.1 kb的DNA片段。

沈立明等（2006）利用针对潮霉素标记基因（hpt）不同大小片段的PCR扩增体系，对hpt在转基因大米加工食品中的稳定性进行研究，结果显示，加工米饭、粥大于500 bp的片段已降解，仅能扩增出植物叶绿体基因rbcl片段，爆米花和锅巴大于236 bp的hpt片段已降解，所有扩增均为阴性。hpt在转基因大米加工食品中均已不同程度的发生了降解，不同加工方式对hpt片段降解影响显著，在加工后hpt以较大或完整片段向食品或消化道微生物转移的可能性减小。

覃文等（2003）为确定加工过程如加热温度和时间对PCR定量检测的影响程度，将玉米粉经由不同温度和时间处理后，提取DNA并进行定量检测。研究发现，经过加热处理后，加入到PCR反应体系的外源基因DNA模板量受加热的温度和时间影响很大，加热温度越高、时间越长，Ct（循环次数）值越大，但对于内源参照基因检测的影响不明显;当加热温度高且时间长(121℃、30 min)时，PCR反应也不稳定，表现Ct值变化较大。由此说明DNA被破坏严重时，目标DNA量越少，对PCR反应的影响越大，此时若要得到理想且稳定的检测结果，在检测加工产品中转基因成分时，应适当增加加入到PCR反应体系中的目标DNA。

Anklam(2002)和 Yamaguchi(2003)等研究发现，酸性pH值对DNA的磷酸键产生破坏，从而造成DNA的降解。青贮加工是最简单的饲料加工方式，经过对青贮饲料的检测，发现其中的DNA保持完整，说明这种加工方式对DNA的降解无明显作用。然而Hupfer等研究认为，青贮为加速DNA降解提供了一种促进条件，经过长期贮存后，基因保持完整并保留功能的可能性很小。

陈颖等（2005）研究表明，外源基因EPSPS在3种大豆加工食品的各个工艺过程中均会受到不同程度的破坏和影响。在豆腐、豆奶、豆粉的加工过程中，片段大小为1512及807 bp的外源基因仅能在原料中检测到。当原料经过磨浆后，EPSPS基因的片段大小骤然降至800 bp以下，点浆、加热等工艺又使得外源基因继续降解至400 bp左右，随着挤压成型、高温杀菌及喷雾干燥工艺的完成，3种大豆产品中目的基因片段大小仅为190 bp左右。

本实验室通过设计挤压膨化处理转抗草甘膦基因大豆试验，结果表明，当温度为100℃时，挤压膨化对外源基因的降解作用并不明显；在温度为115℃的挤压条件下，EPSPS基因的片段大小降至807 bp，其外源基因仅能检测到408 bp大小的片段，当挤压温度达到130℃时，外源基因片段骤然降至206 bp以下，基因组电泳结果表明，温度越高，基因组浓度越低，拖尾现象越严重。挤压膨化包括高温、高压以及机械剪切，使外源基因在不同的挤压工艺加工过程中受到不同程度的降解。对外援基因降解而言，挤压膨化温度是主要的影响因素，其次为剪切作用，二者的复合作用是正向加强的。