臭氧对DNA芯片荧光信号的破坏作用观察

梁惠仪,林来兴妹,陈白虹,李 明

(南方医科大学生物技术学院,广州 510515)

基因表达DNA芯片或检测芯片的原理是用花青素类染料 (Cy3、Cy5)标记的 dCTP掺入到 cDNA或 cRNA中,再与芯片上的DNA探针杂交,通过扫描获得标记的 cDNA或 cRNA的荧光信号强度来检测基因的表达或特定的核酸片段。有许多因素会影响到最后信号的获取,因此在芯片实验的操作过程中必需进行严格的质量控制[1,2]。文献报道,Cy5在大气中臭氧的作用下荧光强度会下降[3]而影响芯片实验结果。在臭氧水平达 10 ppb左右时 Cy5即开始迅速被破坏[4]。夏季大气中的臭氧可达 100 ppb。同样,许多实验室环境中臭氧的水平也较高。为了解决臭氧破坏荧光染料导致荧光信号降低的问题,2009年 11月,我们观察了臭氧对芯片实验中荧光信号的破坏作用,并设计了简单的装置,使芯片实验操作空间中的臭氧下降到较低的水平,以提高芯片实验中荧光信号的稳定性和扫描结果的可信度。

1 材料与方法

1.1 DNA芯片的制备、杂交和清洗 从人类基因组序列中随机挑选了 60个基因,用 Primer premier 5.0软件分别设计引物,挑选其中没有错配的引物,进行 PCR反应,得到了 60条长度为 500～850 bp的cDNA探针。采用 OmniGrid 300芯片点样仪在 25 mm×75 mm片基上点制 DNA芯片。60个靶基因的 PCR产物混合后,使用Random Pr imerDNA Labeling KitVer.2.0进行 Cy5、Cy3荧光标记,标记的产物配制杂交液,在杂交仪中 42℃杂交 16 h。杂交后的芯片在 2×SSC、0.1%SDS洗液中清洗 5 min,转移到 0.2×SSC中清洗 2 min,最后转移至双蒸水中清洗 2 min,甩干,可用于扫描。

1.2 臭氧的测定和清除 采用 aeroqual S200臭氧测定仪测定空气中的臭氧,精确到 5 ppb。从扫描仪底部连续通高纯氮气 1 h,以清除扫描仪中的臭氧。

1.3 芯片的扫描、数据提取和分析 用 GenePix 4000B扫描仪扫描芯片,用 GenePix Pro 6.0软件提取和分析芯片的扫描数据。取芯片上每个点所有像素的中位数减去背景的中位数作为该基因的荧光强度。清除臭氧前,扫描后提取数据,采用相同的光源和P MT强度重新扫描,在 0、19、30、40、62、76、98、109、120 min扫描,共 9次。清除臭氧后,扫描后提取数据,采用相同的光源和 P MT强度重新扫描,在 0、15、30、45、58、75、98、119、140 min扫描,共 9次。

2 结果

2.1 臭氧对荧光信号的破坏作用 在使用高纯氮之前,实验室中的臭氧水平达 22 ppb,在此环境中对杂交的芯片进行清洗和扫描,0、19、30、40、62、76、98、109、120 min时 Cy5的荧光信号强度百分比分别为100%、89%、76%、64%、42%、36%、32%、29%、25%。随着扫描时间的延长,Cy5的荧光信号强度迅速减弱,约 50 min时降低至开始时的 50%左右, 120 min后信号强度小于开始时强度的 20%。在这个过程中,对Cy5的荧光信号变化曲线作指数回归分析,相关系数为 0.997 9,即荧光信号以指数的趋势递减,前60 min荧光强度减弱了近60%,后60 min仅从42%减弱到 25%。表明 22 ppb的臭氧足可对 Cy5的荧光信号造成严重破坏,且破坏的速度非常快。随着扫描时间的延长,Cy3的荧光信号强度没有明显的变化,在 120 min内扫描 9次的平均荧光强度百分比为10.6%±3%,变异系数(CV)=2.8%。Cy3荧光的稳定性显著高于Cy5。

2.2 清除臭氧对芯片荧光信号稳定性的影响 为了消除臭氧对 Cy5荧光信号的破坏作用,在芯片扫描之前对芯片扫描仪通高纯氮,并监控臭氧水平,1 h内可以使室内扫描仪区域的臭氧稳定在 5～6 ppb,延长通气时间无法使臭氧水平降低。

待室内臭氧水平稳定后,将杂交好的芯片清洗并扫描,0、15、30、45、58、75、98、119、140 min时 Cy5的荧光信号强度百分比分别为 100%、98%、96%、97%、94%、95%、91%、93%、89%,即当臭氧水平降低到 5～6 ppb时,Cy5荧光信号强度减弱不明显。在60 min内,Cy5的荧光几乎没有减弱,如果扫描能在此时间内完成,即可得到比较准确的数据,即使连续扫描 120 min,也能得到 90%左右的信号强度。Cy3的荧光强度仍然基本维持稳定。

3 讨论

DNA芯片实验获得的数据受到芯片点样、样品制备和纯化、荧光染料掺入和杂交条件等因素的影响,影响明显时芯片数据不可信[4]。本研究结果表明,在芯片的扫描和提取数据过程中,如果臭氧水平＞20 ppb,扫描时间过长会使 Cy5的荧光受到破坏(与 Cy3不同的是,Cy5分子中存在连续的双键,非常容易受到臭氧的氧化作用而被破坏),那么提取的 Cy5、Cy3荧光比值数据就会产生错误。

Branham等[5]通过对改造实验室通风系统,安装高效吸收臭氧的活性炭的方法,可以将实验室内的臭氧降低到 5 ppb以下。本研究通过通高纯氮气的方法,可使臭氧降低到 5～6 ppb,这个水平的臭氧对Cy5的荧光没有明显的破坏作用,可以大大提高扫描结果的稳定性和可信度。直接通高纯氮气的方法比较简单,在芯片扫描实验前通气 1 h左右即可。

[1]Bammler T,Beyer RP,Bhattacharya S,et al.Standardizing global gene expression analysis between laboratories and across platforms [J].NatMethods,2005,2(5):351-356.

[2]Draghici S,Khatri P,Eklund AC,et al.Reliability and reproducibility issues in DNA microarray measurements[J].Trends Genet, 2006,22(2):101-109.

[3]Fare TL,Coffey EM,Dai H,et al.Effects of atmospheric ozone on microarray data quality[J].Anal Chem,2003,75(17):462-467.

[4]ShiL,TongW,Goodsaid F,et al.QA/QC:challenges and pitfalls facing the microarray community and regulatory agencies[J].Expert RevMolDiagn,2004,4(6):761-777.

[5]Branham WS,Melvin CD,Han T,et al.Elimination of laboratory ozone leads to a dramatic improvement in the reproducibility of microarray gene expression measurements[J].BMC Biotech,2007,7 (1):878-892.