非小细胞肺癌 EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较

陈顺平 余英豪

近年来,随着对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)发生、发展过程中分子生物学机理的深入研究,以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗在NSCLC的治疗中日渐突出。因此,检测 EGFR基因不但可以有效指导分子靶向药物的使用,而且可以为肺癌的治疗措施的制定、以及肺癌预后的判定提供了重要的信息。本文拟采用荧光原位杂交(FISH)技术对我院非小细胞肺癌石蜡样本进行 EGFR基因进行检测,并结合免疫组化法检测 EGFR蛋白表达的情况,比较 2种方法的差异,为临床筛选 EGFR酪氨酸激酶抑制剂适用者及选择最佳治疗方案提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

标本来源:27例患者均为我院 2009年 6月 ～2009年 12月行肺癌手术切除的病例,其中男性 15例,女性 12例;年龄 43～79岁,中位年龄 61岁。所有标本均经 10%中性缓冲福尔马林液固定,常规石蜡包埋。病理类型:肺泡癌 10例、肺腺癌 9例、混合癌 8例。27例同时进行免疫组化及 FISH检测。

1.2 主要试剂与仪器

酸性亚硫酸钠(美国 Simga产品),蛋白酶 K(美国罗氏产品),探针:GLPEGFR/CSP7探针由北京金菩嘉公司提供。人抗 EGFR单克隆抗体(即用型)购于福州迈新生物公司,产品编号 MAB0196。

Olympus BX51型荧光显微镜、Dake原位杂交仪、电热恒温水槽、隔水式恒温培养箱。

1.3 方法

1.3.1 检测方法 FISH检测:①将 3μm组织涂胶切片浸于二甲苯中脱蜡至水。②50℃下用 30%酸性亚硫酸钠处理组织切片 30～40 min。③室温下用 2×SSC×3min×2次漂洗。④在组织上滴上自己配制即用型蛋白酶 K,在 37℃预热的孵育盒中消化 25～35 min。⑤室温下用 2×SSC×3 min×2次漂洗,乙醇梯度脱水固定,自然干燥。⑥避光环境中,玻片和探针混合液(7μl杂交缓冲液、1μl去离子水和 2μl探针),探针混合液滴于杂交区域,在温度 83℃的自动杂交仪中变性 6 min后置 37℃过夜杂交。⑦洗涤:第 2日移去盖玻片,在温度 46℃,玻片置于 2×SSC×10 min×2次,2×SSC/0.1%NP-40溶液中 5 min。玻片干燥后加 DAPI复染液,放于暗盒中复染数分钟后用 OLYMPUSBX51荧光显微镜在 DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号。

IHC检测:采用 EnVision二步法,EGFR一抗工作浓度为 1∶150,严格按照说明书操作。

1.3.2 结果判定 (1)FISH结果判定:红色信号代表检测的靶基因,绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测 EGFR基因计数 100个细胞,统计 Ratio值(100个细胞核中红色信号数/100个细胞核中绿色信号数)。FISH阳性分为:EGFR基因扩增:①Ratio≥2为阳性结果;②≥15个红色信号的细胞数占细胞总数的 10%以上;③出现成团红色信号的细胞;高多体性:Ratio＜2,但≥4个红色信号的细胞数占细胞总数的40%以上。FISH阴性:Ratio＜2为无扩增。(2)IHC结果判定:染色结果根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。着色细胞占计数细胞百分率≤5%为 0分;6～25%阳性细胞为 1分;26～50%阳性细胞为 2分;＞50%阳性细胞为 3分。再结合染色强度,无色为 0分,浅黄色 1分,棕黄色 2分,棕褐色 3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘,为其最后得分。同一视野如有染色强度不一,取其平均值作最后得分。0～1分为阴性(-),2～3分为弱阳性(+),4～6分为中等阳性(2+),6分以上为强阳性(3+)。

1.4 统计学处理

采用 SPSS13.0统计软件进行描述性分析。

2 结果

27例 NSCLC标本中,IHC法检测 EGFR表达(3+)的 14例,有 9例 FISH显示阳性 (64.29%),这 9例中有 5例为 EGFR基因高多体性扩增(55.56%),4例为 EGFR基因扩增(44.44%);IHC为(2+)的 6例标本中,仅有 1例为高多体性扩增(16.67%);IHC为(1+)的 2例以及 5例 IHC(-)的标本均无 EGFR基因扩增。在 10例扩增的标本中,高多体性扩增(6例)超过一半。

3 讨论

EGFR属于表皮生长因子家族成员[1],又称HER1,EGFR基因位于人类 7号染色体的短臂,由 118 kb组成,包括 28个外显子。EGFR在多种上皮性肿瘤中呈高表达,其过表达与肿瘤细胞的增殖、活动性、粘连性、侵袭性、凋亡抑制和血管生成相关,能导致其下游信号传递过程异常激活,使细胞的转化、增殖加快,抵抗细胞凋亡、细胞生存期延长,与肿瘤的发生、发展、预后以及治疗反应等相关[2]。EGFR在上皮性肿瘤发生发展过程中发挥着关键作用,配体通过 EGFR信号通路来调节细胞增殖、存活和血管生成,由于 EGFR酪氨酸激酶是信号传导的必要条件,因而成为肿瘤治疗的重要靶分子。通过选择性的酶抑制剂或单克隆抗体竞争性结合细胞外配体结合位点可以阻断酪氨酸激酶活化,从而抑制 EGFR的激活,阻碍肿瘤的发生发展。以 EGFR为靶标的分子靶向药物如 EGFR酪氨酸激酶抑制剂 Iressa(Genfitinib)已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗晚期 NSCLC,治疗 EGER基因扩增 NSCLC患者中,有效率为 35%,疾病控制率高达70%[3]。同时,多数临床 III期试验表明,EGFR高拷贝数患者使用酪氨酸激酶抑制剂后生存显著高于 EGFR低拷贝数患者,因此,EGFR拷贝数被认为可能适合作为用药后生存期判断的指标[4,5]。

IHC是目前临床上常用的检测 EGFR蛋白表达的方法。该方法简便、价廉、可重复性好、对材料的要求不高,在临床上广泛应用,是国内检测 EGFR蛋白表达的主要方法。但是,IHC方法在标本固定和处理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果,易造成假阴性或假阳性,且结果判断人为主观性较强 。FISH是近年来发展起来的分子生物学技术,已被广泛用于临床医学检测,且 FISH技术敏感性和特异性高、简便快速、客观性强,实验过程中受到的影响较小,检测结果准确,也可以定量判读结果,但费用相对较昂贵。

本实验中,我们对 27例 NSCLC患者进行 FISH检测 EGFR基因状态并结合其免疫组化结果进行对比分析发现,当 IHC法为强阳性(3+),FISH阳性符合率仅为 64.29%,符合率较低,而对于(2+)的患者中,只有 1例为高多体性扩增,符合率为 16.67%。因此,我们认为,对于 IHC为阳性(3+)和(2+)患者需再做FISH实验确定是否存在 EGFR基因扩增。IHC法为(+)或者(-)的标本,FISH法的结果均为无扩增。同时,在 10例扩增的标本中,有 6例为高多体性扩增,占到扩增例数的大多数,说明由 7号染色体引起的EGFR基因多体性扩增较为常见,其镜下表现为癌细胞核中红色信号点数较多,但还未成团,信号各个点数清晰易辨,伴随着染色体着丝粒绿色信号点数的增加。同时,我们在判读过程也发现除了多体性扩增引起的红色信号点数增加外,EGFR基因扩增镜下一般表现为红色信号点成簇状集聚。因此,我们认为对于 IHC法初筛为阴性(-)或(+)的患者,基本上可排除 EGFR基因扩增;而对于 IHC法初筛为(3+)和(2+)的患者,2种方法的符合率相对较低,特别是(2+)的患者,在应用靶向药物治疗前均应进行 FISH检测以确定 EGFR基因的状态。

综上所述,应用 FISH技术对 EGFR基因扩增检测可以对 IHC的补充,也避免 IHC假阳性对 NSCLC患者应用酪氨酸激酶抑制剂治疗效果的误判,增加患者的负担。同时,FISH是1种快速,简便,结果可靠的基因检测方法,易在临床得到认可。IHC的经济性可用于排除 NSCLC患者中 EGFR基因的扩增,FISH可用于确诊,这 2种方法相互补充将对于临床应用酪氨酸激酶抑制剂具有指导作用。

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