液相色谱-质谱法在非法添加化学药物检测中的应用

2010-04-13北京市海淀区药品检验所100083饶金华

首都食品与医药 2010年6期

北京市海淀区药品检验所(100083）饶金华

北京市垂杨柳医院（100022）陆红柳

北京市海淀区药品检验所(100083）李东辉王永欣

非法添加化学药指在中成药中添加与此中成药疗效相似或者一致的西药成分，以提高疗效、增加销量的一种不法行为。检测中成药中是否非法添加化学药的工作至关重要。中药制剂通常含有多种中药材，每种药材的成分又复杂多样，鉴别检查此类复杂化学环境中非法添加的化学成分，选择专属性高的分析手段尤为关键，液相色谱-质谱法（LS-MS）由于具有高度专属性，成为国内外研究普遍采用的方法。现将有关研究近况综述如下：

1 液相色谱-质谱法原理及应用

HPLC-MS 是当前鉴别检查中药制剂中掺入化学药物的有效分析方法之一。由于其分析不需要实现待测物质与干扰组分的完全色谱分离,可以通过对质荷比的筛选得到单一组分的色谱图，同时还可以通过二级质谱分析对结构做进一步确证。更重要的是,常规的HPLC分析时，如果手头没有相应的对照品，实验就很难开展，但HPLC-MS 可从得到的质谱信息中筛选出供试品中各组分的准分子离子峰质荷比，从而推断其分子量，将得到的分子量信息与相关文献资料比较,从中可以发现有价值的信息。事实上,质谱相当于一种特殊的HPLC检测器。色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析，而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。

2002年，美国质谱协会统计了药物色谱分析各种不同方法所占的比例。1990年，HPLC高达85%，而2000年下降到15%，相反，LC-MS所占的份额从3%提高到大约80%。我国目前在这方面相当于美国九十年代的水平，液相色谱-质谱技术在我国有着广泛的发展空间。

2 具体应用

2.1 止咳平喘类制剂的检查刘起中等采用XTerra C18柱(5μm,2.1 mm ×150 mm)，以甲醇-10mmol/L醋酸胺溶液为流动相，以梯度洗脱程序进行洗脱。通过与对照品的液相色谱保留时间、相对分子质量、二级质谱信息比较，对治疗哮喘中药制剂中非法掺入的化学药物进行鉴别，分别检测到沙丁胺醇、茶碱、醋酸氢化可的松、醋酸泼尼松四种化学药物。夏瑞、车宝泉、张喆等建立了鉴别中药制剂中可能添加的糖皮质激素的液相色谱-质谱分析方法。针对不同的中药剂型，采用不同的试样处理方式。提取后的样品溶液采用Diamond C18柱(5μm,250 mm ×4.6 mm)分离，以流动相A （水-四氢呋喃,体积比为100∶1）和B （乙腈-水-四氢呋喃，体积比为80∶20∶1）进行梯度洗脱。通过与对照品保留时间、一级质谱及二级质谱图的对比进行定性。应用该法鉴定了中药制剂中的糖皮质激素，在供试品溶液中检出了醋酸泼尼松等15种糖皮质激素。张西如、姜建国、张素萍等采用液相色谱-质谱联用法。选用VenusilMP C18柱，以0.01mol·L-1醋酸铵（含0.1%醋酸） -乙腈（60∶40）为流动相，对非法添加醋酸泼尼松的复方川羚定喘胶囊制剂的提取液进行液相色谱-质谱联用分析。通过与对照品的色谱、紫外及质谱行为相比较，对此类非法添加醋酸泼尼松的药物进行定量测定和定性鉴别。结果在这些制剂中均检出醋酸泼尼松，且回收率为98.62% （n=6）。

2.2 降糖类制剂的检查董宇、孔璋、钟大放等采用液相色谱-离子阱质谱联用法。选用Diamonsil C18柱，以乙腈-水-甲酸（V ∶V ∶V=60.0∶40.0∶0.1）为流动相，对中药降糖制剂的提取液进行液相色谱-离子阱质谱分析。通过与对照品的色谱及质谱行为相比较，对中药降糖制剂中非法掺入的合成降糖药进行定性鉴别。结果在4种受试中药降糖制剂中，2种被检测到同时掺有苯乙双胍和格列本脲，1 种被检测到掺有格列本脲。郑成、向智敏等以Altima C18色谱柱为固定相，以乙腈-0.1%甲酸溶液（65：35）为流动相，用液相色谱-质谱-质谱法进行定性分析鉴定。

结果显示，在一批降糖胶囊中检测到非法掺入的化学药格列本脲和苯乙双胍。程显隆、刘卉等以Agilent C18柱(5μm,250 mm ×4.6 mm)分离，以甲醇-0.1%甲酸水溶液（30∶70）为流动相，流速为1.0ml/min）分流比为4：1。采用电喷雾离子化正离子检测模式（ESI＋），m/z范围为100-800amu，毛细管电压为＋3.2kV，脱溶剂气（N2）为350L/h，锥孔反吹气为50L/h，锥孔电压为45V，脱溶剂温度为150℃，源温度为105℃，检测方式为全扫描质谱。根据液相色谱保留时间、相对分子质量及源内CID（碰撞诱导裂解）碎片离子等信息，对中药降糖制剂及胶囊壳的提取液进行液相色谱-质谱分析，在市售某中药降糖制剂中检测到罗格列酮。吴美香、李焕德采用HPLC-MS 法，质谱条件：采用电喷雾电离正离子源(ESI +)，毛细管喷口电离电压3kV，孔电压45 V，离子源温度105℃，去溶剂气温260℃，去溶剂气流速420L/h。采用选择离子监测（SIR）模式进行定性分析。色谱柱:Thermo TM C8（250 mm ×4.6mm，5μm），柱温40℃，检测波长230 nm，流动相梯度洗脱程序：乙腈-30 mmoL/L 醋酸铵溶液(5∶95～30∶70,0～20 min)，(30∶70～65∶35，20～40min)，（65∶35～5∶95,40～45 min），（5∶95，45～50 min）,流速1.0 ml/min，进样量20μl。

结果显示，本实验建立的条件能够把中药制剂中添加的磺酰脲类（格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮）和4 种硝基咪唑类药物（甲硝唑、替硝唑、奥硝唑、塞克硝唑) 同时完全分离开来。对8种制剂建立的检测技术进行了分析，经与相应的标准物质比较，得到有2种中成药中非法掺有降糖化学药品格列本脲：有2 种中成药制剂同时非法掺入了降糖化学药品格列本脲和格列齐特。

2.3 抗风湿类制剂的检查刘福艳、谢元超等采用Agilent C18柱(5μm,150 mm ×4.6 mm)分离，以0.02mol/L醋酸胺-1%醋酸溶液-甲醇（32：3：65）为流动相，流速为0.4ml/min，柱温30℃。采用电喷雾离子化负离子检测模式（ESI－），m/z范围为100-400amu，干燥器温度350℃；干燥气流速10L/min；干燥气压力为276kPa；源电压为5kV。通过液相色谱保留时间、一级及二级质谱碎片等信息，对抗风湿类中药的提取液中非法掺入的萘普生、吲哚美辛进行定性鉴别，在6批抗风湿类中药中3批检出萘普生，其中2批同时检出吲哚美辛。

2.4 降压类制剂的检查高青、张喆、车宝泉等采用Waters Sunfire C18色谱柱，梯度洗脱：流动相A为20 mmol/L 醋酸铵溶液，流动相B为甲醇-乙腈（2∶1）,检测波长为230nm,流速为1 ml·min-1（分流比为4∶1）。选择正负离子全扫描方式检测临床常用的15种降压药，利用质谱解析软件研究了上述化合物的质谱裂解规律。通过比较样品峰与对照品峰的一级质谱、二级质谱质荷比，确定样品中是否掺杂了化学药物。结果在上述色谱及质谱条件下，15种降压药物HPLC图谱分离度良好，质谱分辨率符合鉴别要求。HPLC-MS/MS方法测定上述化学物质的最小检出量为1～80ng。

2.5 减肥类制剂的检查车宝泉、张喆、黄晓君采用UtimatesXB-C18色谱柱，梯度洗脱：流动相A为含0.1%醋酸的20 mmol/L 醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，流速为1 ml·min-1。选择正负离子全扫描方式检测临床常用的10种减肥药，利用质谱解析软件研究了上述化合物的质谱裂解规律，通过比较样品峰与对照品峰的一级质谱、二级质谱质荷比,确定样品中是否掺杂了化学药物。结果检出西布曲明、芬氟拉明、酚酞。样品各色谱峰间分离度良好，质谱分辨率符合要求,最小检出量为2～100ng。王珂等采用Agilent C18柱(5μm,150mm ×2.1mm)分离，分别以不同比例的0.5%甲酸溶液-乙腈或0.5%甲酸溶液-甲醇进行梯度洗脱：流动相A为含0.1%醋酸的20 mmol/L 醋酸铵溶液，流动相B为甲醇，流速为1ml·min-1。质谱条件：离子源ESI，雾化气压力2.07×105Pa，干燥器温度350℃；干燥气流速8L/min，自动扫描方式。结果在1000批供试品中分别检测到西布曲明、芬氟拉明、咖啡因、番泻苷、酚酞等。

2.6 苏丹红系列染料的检查冯家力、王一红、丁力等建立了苏丹红系列染料（苏丹I、苏丹II、苏丹III、苏丹IV）灵敏、专一的液相色谱-质谱检测方法。将样品用乙腈提取过滤后，无需其他处理，直接用95 %乙腈+5 %水（含0.1 %甲酸）为流动相进行反相液相色谱分离，用电喷雾正离子源进行离子化，选择反应监测方式（SRM）对这4种物质各自的母离子（m/ z249、277、353、381）及其4对子离子（m/ z232和93、121 和106、197和92、225 和106)进行监测,三级四极质谱测定;用全扫描方式对每种物质进行了结构解析。

结果表明，样品处理极其简单，7min内完成分离，方法抗干扰能力强，回收率98 %～103 %，检出限0.02～0.04μg/ L，RSD0.8 %～1.6 %，相关系数0.9993～0.9998；同时首次发现食品中添加有与苏丹III 和IV结构极其近似的同分异构体存在，且其同分异构体也为红色物质。