microRNAs的临床运用探讨

郭建生，陈士伟

(1、空军杭州航空医学鉴定训练中心，浙江 杭州 310007；2、长海医院实验诊断科，上海 200433)

1993 年Lee等[1]利用遗传分析的方法在秀丽隐杆线虫中发现第一个22个核苷酸的小分子非编码RNA-lin-4开始，microRNA(miRNA)被带入了研究领域，但直到最近几年这类基因的多样性和广泛性才被揭示出来。一系列的研究表明，microRNA在机体正常发育、分化、生长及凋亡中发挥重要的作用，如胚胎发育、细胞生长和凋亡、血细胞分化、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生和脂肪代谢等，随着研究的进展，对miRNA的研究从量的表象变化已经慢慢过渡到作用机制，进入了更深一步的研究。随着检测方法的进步，一个新的领域—循环miRNA也逐渐成为科研的热点，成为潜在的检测标志物和治疗靶向点。miRNA与多种疾病的发生发展存在密切的关系，本文对此进行部分阐述。

1 miRNA概述

miRNA(miRNA)是一类有大约1923个核苷酸组成的非编码小分子RNA，广泛存在于真核生物中，在细胞增殖、分化、凋亡、个体发育、病毒感染及肿瘤的发生发展等方面具有重要的生物学功能。它们由细胞核内基因组DNA转录成RNA，经过特异性核酸酶drosha第一次切割形成pre-microRNA，利用运输蛋白-5到达胞浆后再经过Dicer酶的第二次切割而得到成熟miRNA，其通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)靶向到达 mRNA，与靶基因 3’端非翻译区(3’UTR)完全或部分互补结合，导致靶mRNA翻译抑制并参与RNA干扰反应，使相应基因表达水平下降[2]。miRNA与靶mRNA完全互补配对后，mRNA被降解，若miRNA与靶mRNA不完全互补，则起到封闭靶mRNA的作用，抑制其翻译过程[3]。编码miRNA的基因占全部预测基因的1～5%，每种miRNA可调控多种靶基因，一个靶基因可能受不同miRNA的调控，改变人类蛋白基因的表达，维持机体的功能[4]。

2 miRNA与疾病

2.1 miRNA与肿瘤

miRNA表达与肿瘤的相关性是最有吸引力的研究。提取肿瘤组织细胞的RNA，利用microarray分析发现多种肿瘤组织与周围的正常组织相比较miRNA表达水平有不同程度的上调或下调，发生miRNA图谱改变，这一现象初步肯定了肿瘤发生与miRNA表达之间具有一定的相关性。已经有大量文献报道疾病中有关的组织或细胞miRNA图谱发生变化，特别是肿瘤miRNA表达谱可以提示其组织来源，同时也证明miRNA表达谱有助于人类肿瘤的组织分型，而且miRNA表达谱在提示组织谱系方面比传统的miRNA表达谱效果更好。此外，miRNA表达谱还可以为低分化肿瘤找到其组织来源[5]。

miRNA既可作为抑癌基因，下调原癌基因的活性，也可作为癌基因，下调抑癌基因的活性。Calin GA等[6]首次验证了microRNA在某些类型的白血病和淋巴瘤中发生了功能障碍，其中miR-15和miR-16起着关键作用，这两种miRNA通过抑制Bcl-2蛋白的表达调节细胞凋亡过程，Bcl-2蛋白主要通过作用于线粒体来实现其抑制凋亡的生物学活性，因此当miR-15和miR-16丢失或突变时，Bcl-2蛋白的表达量上调，细胞凋亡受阻，因而导致肿瘤发生。作为癌基因的miR-21，研究证明在胶质母细胞瘤中表达升高，同时乳腺癌样品中表达也有增加，故认为miR-21可能在肿瘤发生中起到广泛的作用。而人的肺癌细胞中瞬时的表达let-7，作为抑癌基因，可以抑制细胞的增殖，如果肺癌患者的let-7表达降低，患者预后更差，非小细胞肺癌患者的let-7表达水平越低，其预后越差，术后生存期越短。同时最近研究也发现miR-31抑制抑癌基因促进肺癌的发生，它作用的目标基因是抑癌基因Last2(large tumor suppressor 2)和Ppp2r2a(PP2A regulatory subunit B alpha isoform)，与它们结合后促进肿瘤的生成，抑制抑癌基因发挥抑癌作用，人工敲除miR-31，Lats2和Ppp2r2a表达明显上升，肺癌病人和肺癌鼠的miR-31和目标mRNA的表达相反，充分证实了这个结论[7]。

2.2 miRNA与内分泌疾病

在我国内分泌疾病有很大的人群，从功能上说主要表现为两种情况，一是功能亢进，二是功能减退，虽然发病缓慢，但对病人造成的痛苦不可小觑。miRNA的出现为内分泌疾病的诊断和治疗带来了新的思路和方法。从胰腺B细胞分泌、胰岛素的作用等每个环节都有miRNA的参与，而且影响其它相关分子。对来自1型糖尿病和正常人的Treg细胞进行miRNA筛查，利用TaqMan arry分析发现与正常人相比1型糖尿病病人Treg细胞miR-510上升近100倍，而miR-342和miR-191下降为近2倍和3倍。虽然具体的作用机制还没有明确，但图谱的改变已经说明miRNA在1型糖尿病中的重要作用[8]。

雌激素受体(ERα)是配体激活的转录因子，由荷尔蒙、DNA、和转录活化因子几个重要结合区域组成，miR-22与表达ERα的mRNA的3’端非翻译区(UTR)结合强力抑制ERα产生，过表达的miR-21通过诱导mRNA的降解而使ERα产生减少使雌激素的作用减弱，因而可以从另一方面思考miR-21的过表达可以抑制雌激素依赖性乳腺癌细胞的生长[9]。MiR-18已经被证实作用于编码ERα的基因ESR1，过表达MiR-18降低ERα水平但同时促进肝癌细胞 (HCC)的增殖，对女性肝癌病人来说miR-18的过表达阻碍了雌激素潜在的保护作用而促进了肝癌的发展[10]。

2.3 miRNA与自身免疫性疾病

已经证实miRNA在免疫调节和免疫细胞发育扮演了重要角色。到目前为止，已经揭示一群特异性的miRNA在免疫系统中发挥重要的调节作用。利用LPS对人monocytic THP-1细胞进行刺激发现miR-146、miR-155和miR-132上调，TNF-a和IL-1b可以诱导miR-146的表达。进一步的分析揭示这是NFkB依赖性的[11]。由IFN-b和多种TLR配体的作用，鼠巨噬细胞miR-155表达上升，这些说明miR-155参与细菌和病毒的先天性免疫。而LPS刺激鼠巨噬细胞会引起miR-125的下调，因此推断miR-125可能作用于TNF-amRNA，在LPS诱导TNF-a产生时miR-155表达下调[12]。系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种自身免疫性疾病，产生多种自身物质的抗体包括染色质、核糖和磷脂等而且临床表现多样。Dai等利用microarry分析来自23名SLE患者和10名健康者的外周血单核细胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)miRNA的表达，结果得出7种 miRNAs(miR-196a，miR-17-5p，miR-409-3p，miR-141，miR-383，miR-112，and miR-184) 表达下调，9 种 miRNAs(miR-189，miR-61，miR-78，miR-21，miR-142-3p，miR-342，miR-299-3p，miR-198，andmiR-298)表达下调[13]。对狼疮肾炎活检组织的miRNA的图谱分析也有改变，36种上调和30种下调[14]。这些资料表明对于SLE患者miRNA可作为潜在诊断标志物和疾病相关分析因子。

2.4 miRNA与其它

皮肤是人体分布最广的器官，在表皮和毛囊中的一些miRNA的高表达是皮肤正常发育必不可少的，将鼠胚胎皮肤祖细胞Dicer敲除发现皮肤上皮不能产生成熟miRNA，毛胚芽进入表皮层而不是正常的到真皮层。正常毛囊分化关键信号分子(sonic hedgehog，Shh 和 Notch homolog 1，Notch1)的表达在出生后7d消失[15]。MiR-203与皮肤形成有关，胚胎发育至13.5～15.5d时，鼠基底层细胞相比基底细胞miR-203增高25倍，miR-203抑制p63的表达，p63是表皮细胞增殖和分化的重要因子[16]，在胚胎形成中p63基因启动上皮形成，维持表皮基底层成熟角质细胞的增殖潜力。皮肤microRNA的改变会引起增殖、分化的错误信号，最终导致皮肤疾病的产生。

3 循环miRNA

3.1 循环miRNA的来源与检测方法

对于循环miRNA的来源目前主要观点有：循环RNA来自于凋亡或坏死的细胞，细胞的主动释放，以及循环细胞的裂解.但对于特定循环miRNA的真实来源还存在许多未知的因素。研究表明，内源性的循环RNA分子具有良好的抗RNase降解能力，有较高的稳定性。虽然目前机制还不是很清楚，但并不影响对其的研究。为了验证内源性miRNAs在血浆中的稳定性，Mitchell等[17]将血浆放置室温24h或经过8次冻融对目的基因的量进行测试发现影响很小，没有显著差异，充分证实了miRNA在血浆中的稳定性，具备作为临床检测指标的条件之一。

目前对microRNA的检测主要有两种方法，一是利用microarray芯片，对基因进行筛查，二是利用real-time PCR对目的基因进行相对定量检测，有Taqman探针和SYBgreen法，Taqman探针因其具有特异、敏感和快速优于SYBgreen法而逐步成为实验方法的金标准。由于在血清中miRNA的含量少且其分子量小，因而在进行样本抽提时不同于普通的RNA抽提。利用mirVana PARIS试剂盒，用等体积酸性酚-氯仿抽提样品以去除蛋白成分，通过不同梯度100%乙醇的加入达到对不同RNA成分的分离最终获得高浓度的miRNA洗脱液用于下面的逆转录和定量检测。

3.2 循环miRNA是检测的潜在标志物

与组织表达的miRNA一样，循环miRNAs首先最广泛地用于对肿瘤疾病的研究。在血清中检测肿瘤组织中高表达miRNA并对其分析来判断miRNA对疾病诊断、治疗、预后的检测作用。循环miR-1可作为急性心肌梗死 (acutemyocardial infraction，AMI)的潜在标记物，与正常组比较AMI在疾病组的Ct值中值有明显的差别(CtI=32.11，AMI=28.35)，利用ROC 曲线(receiver–operator characteristic curve，ROC)分析来肯定它的诊断价值，并且回归分析miR-1的水平与年龄、性别、高血压、糖尿病等与AMI有关的因素都无相关[18]。miRNA还可用来对怀孕不同时段的监测，与未孕对照组比较孕期第一阶段(6～12周)和孕期第三阶段(34～41周)let-7d、miR-527、miR-520d5p、miR-526a、miR-141 的表达随着孕龄增加而增高，对胎儿发育起到监测的作用[19]。

4 展望

通过miRNA检测达到对疾病的检测、治疗和预后的检测已经是目前关于RNA研究的热点，miRNA的表达有高度保守性、时序性和组织特异性，而且在血清或血浆中通过实验方法可以检测量的表达变化。虽然大部分miRNA的功能和作用机制还没有完全清楚，但其在维持机体健康和疾病监控的作用越来越受到关注。目前蛋白水平检测是在转录翻译后，而miRNA则通过影响转录后翻译达到调控，对疾病的临床意义更大，并且就当前的技术可以很快地建立起miRNA为系统的检测方法，以miRNA为新的检测标志物的建立是可以期盼的。

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