细菌S-layer蛋白的研究新进展

细胞壁在原核生物的生命活动中起着重要的作用，而细胞壁最外层结构的多样性反映了生物体对特定生态环境的适应。经过30多年的研究发现，古细菌及细菌的外表面有一个共同的结构即S-layer(Surface layer)，是由蛋白质成分的亚单元组成的一种单分子二维晶格结构，几乎存在于所有有壁细菌及古细菌中[1]。形态学、化学及形态发生学研究表明，S-layer是进化中形成的一种最基本的生物膜结构[2]；S-layer 蛋白也是细胞内丰度最高的蛋白之一，可高达细菌总蛋白的15%左右[3]。S-layer 蛋白可以在体外自发组装成重复多孔的晶格结构，这一特性使S-layer蛋白在离子选择性结合基质、微载体、生物传感器、疫苗、组织再生中的生物吸附系统等方面具有广阔的应用前景。作者在此对近年来细菌S-layer蛋白的研究及应用进展进行了综述。

1 S-layer 的起源、结构及化学特性

经过近半个世纪的研究，现已发现上百种主要的细菌类群都具有S-layer，包括蓝藻和古细菌。据统计[4]，有200种真细菌及79种古细菌具有S-layer，这个数字还在不断增加。

在不同的细菌中，S-layer结合的部位也不一样。在革兰氏阳性菌及古细菌中，S-layer亚单元与肽聚糖层或伪肽聚糖层连接；在革兰氏阴性菌中，与细胞外膜的脂多糖层偶连；而在大多数缺少明显细胞壁的古细菌中，S-layer是唯一的细胞壁组分，与细胞质膜紧密相连[4,5]。

S-layer大多是由单一的蛋白质或糖蛋白构成的二维晶格结构，表观分子量介于40 000～200 000之间。因为它有最简单的重复性分子结构，因而被认为是进化中形成的最基本的膜结构。

与真核生物的脂质双层膜不同的是，S-layer蛋白只有一种蛋白组成，而且呈周期性排列。S-layer蛋白形成的亚单元在溶液中或者合适的界面上可以重新组装成二维晶格结构，而界面的净电荷、疏水性及特定的亚单元间的连接特性都会影响到S-layer亚单元组装的方向和方式[5,6]。

2 S-layer蛋白的研究进展

近年来陆续对40多种S-layer蛋白基因进行了克隆和测序，发现S-layer蛋白有类似的结构组成。大多数S-layer蛋白由弱酸性的蛋白(或糖蛋白)组成，等电点介于3～6之间，少数几种细菌如Methanothermusfervidus及几种乳酸杆菌的S-layer蛋白的等电点分别是8.4和9～10。S-layer蛋白通常含有大量的谷氨酸和天冬氨酸(总摩尔分数约为15%)，不含或仅含少量的硫氨基酸。圆二色性检测及氨基酸分析表明，40%的氨基酸残基形成β-折叠，20%形成α-螺旋结构[7～9]。

许多古细菌和某些细菌还能糖基化S-layer蛋白，糖基部分是革兰氏阴性菌的O-抗原多糖的主要组分。典型的糖链由20～50个含有中性己糖、戊糖、庚糖及氨基糖的相同重复元组成。革兰氏阳性菌S-layer蛋白的糖链与革兰氏阴性菌的脂多糖更相似，而不同于真核生物的碳链。S-layer糖蛋白的核心寡糖由2～4个糖基组成，大多通过O-糖苷键将碳链与蛋白部分连接。革兰氏阳性菌的S-layer糖蛋白有2～4个糖基化位点，而古细菌中有高达25个糖基化位点，而且主要是N-糖苷键连接[10,11]。

为了与细胞的生长一致以覆盖整个细胞，S-layer基因具有强启动子。Boot等[12]的研究表明，L.acidophilus的S-layer基因启动子效率是乳酸脱氢酶基因启动子的2倍，而后者被认为是细菌中最强的启动子之一。L.brovis的S-layer蛋白表达需要2个启动子，其中一个离起始密码子较近，在细胞生长的对数期及稳定期早期表达，另一个在细胞生长的其它时期表达。B.brevis的S-layer蛋白表达甚至需要3个启动子。

大多数S-layer蛋白的分泌是通过信号肽途径，但是Aeromonassalmonicida、C.fetus和C.crescentus则采用不同的分泌途径[13]，如通过ABC(ATP-binding cassette)转运体或I型转运体。S-layer蛋白也存在一些翻译后的修饰，包括氨基端或羧基端的切除、氨基酸残基的磷酸化和糖基化等。

3 S-layer的功能

S-layer通常是复杂的细胞壁结构的一部分，因此功能上也不是独立或单一的。目前对S-layer的功能了解并不多，很多方面还处于假说阶段，缺乏足够的实验数据支持。

古细菌及细菌S-layer的功能主要有以下3点[14,15]：(1)作为保护衣、超滤分子筛、分子及离子陷阱；(2)作为细胞粘连和表面识别的基质；(3)在革兰氏阴性的古细菌中作为决定细胞形状的骨架。

由于S-layer也存在于人类和动物的多种病原体中，所以研究者对Aeromonassalmonicida、Aeromonashydrophila和C.fetus等[16]病原微生物的S-layer给予了特别的关注，这些研究将会阐明S-layer作为毒力因子方面的意义。

4 S-layer蛋白的应用

4.1 作为超滤膜

因为S-layer是由单个蛋白或糖蛋白组成的周期性排列结构，S-layer蛋白的每个分子单元都可以在亚纳米水平表现出相同的生化特性，形成大小和形态相同的微孔，许多重要的功能基团(如羟基、氨基或羧基等)都以特定的位置和方向在微孔内排列，因而可通过化学修饰以获得特定的S-layer超滤膜，这种超滤膜具有精确分子量并带有不同电荷特性或亲水性及疏水性。通过使用特定孔径大小及生化表面特性的S-layer超滤膜，就可以确定超滤层的微孔大小与净电荷的相关性、被吸附蛋白的分子特性(直径、净电荷等)及由于被吸附到超滤层表面所引起的流量损失等[17]。

4.2 作为固定功能分子的基质

鉴于S-layer蛋白晶格中每个分子的均匀性及其亚单元可以重新聚合的特性，可以使之成为特异性结合不同大小功能分子的理想载体。无论是在溶液中或是附着于支持物上，S-layer蛋白均可作为固定基质以可再生的方式结合单层的功能分子(如抗体、配体、半抗原、免疫原、酶等)。对于糖基化的S-layer蛋白，蛋白质部分及糖基残基都可以用来固定不同的大分子。利用高分辨率的电子显微镜观察到这些被固定的大分子可以反映S-layer晶格的重复方式。这一技术可用于生物分析传感器、免疫测定及结合疫苗等方面[14,18]。

与通常所用的由无定形多聚体组成的有孔支持物相比，S-layer蛋白作为固定基质的优点是：在pH值7.0左右时，S-layer蛋白对大分子的非特异性吸附非常低，几乎没有背景反应；另外，单层酶、配体或抗体在S-layer表面上的有序排列可以避免一些自由扩散反应。在硅板上重新组装的S-layer蛋白可以用深度超紫外放射定型，作为控制生物矿化的基质；表面被金属氧化的S-layer蛋白可以用作纳米材料制成的半引导器表面的模具，用以开发新的光电材料和设备。

4.3 作为功能脂膜的支持物

如何获得在宏观水平上具有特定功能特性的再生生物膜，无论对于基础研究者还是应用研究者都极富吸引力。但是有功能的脂膜都是动态的流动结构，生命期短且稳定性差，从而妨碍了它们的结构功能和应用潜力的长周期研究。无支持物的脂膜瓦解的主要原因在于脂分子的横向摆动性。在极端环境条件下(如低pH值、高盐、高温)生存的古细菌，其细胞壁由S-layer及相连的细胞质膜组成，因此，可以利用S-layer晶格结构来稳定大量再生的功能脂膜。通过将分离的S-layer亚单元注入Langmuir-Blodgett (LB)脂膜的面下相，就可在气-水界面上获得排列在脂膜上的、大量连贯的单分子S-layer晶格结构[19]。这些S-layer支持的LB脂膜可以覆盖许多微孔，孔径可达几个微米，并且在后续的处理中依然保持结构的完整性。这项技术可以用在多个领域，如诊断学、传感器技术、电子或光学设备等。

4.4 融合基因的表面展示

S-layer蛋白的一些结构域允许外源抗原决定簇的插入而不影响其组装成规则的晶格结构，如利用几种乳酸菌的S-layer可将几种具生物活性的抗原决定簇进行表面展示。将SLP SbsA与nontypeableHaemophilusinfluenzae(NTHi)的抗原——其外膜蛋白Omp26融合，在老鼠中可产生Omp26特异性的抗体[20]。

Bohle等[21]将白桦花粉的主要过敏原Bet v 1与B.stearothermophilusATCC 12980的S-layer蛋白SbsC的C-端相融合产生的融合蛋白不仅具备有功能的过敏原，还能自组装成单分子的晶格结构，将该融合蛋白作为疫苗可以安全高效地用于预防I型过敏症。Avall等[22]将Lactobacillus的S-layer蛋白的每一段亲水性结构域都成功地与6个组氨酸的多肽融合表达，并使宿主菌细胞表面产生结合Ni2+和Cd2+的能力。

Pleschberger将BacillussphaericusCCM 2177的SLP与前列腺特异性抗体重链的一个易变结构域序列相融合，所产生的融合蛋白在包被有烃硫基化的次级细胞壁多聚物的芯片上重新聚合结晶。这种高密度、具有特定配基间距的感受层可以用作表面胞质基因谐振生物芯片，以特异性地检测前列腺特异性抗体。

蛋白A的B结构域可以结合IgG的Fc部分，将2个拷贝的人工合成的B结构域的类似物Z-结构域与来自BacillussphaericusCCM 2177的SLP SbpA融合，产生的融合蛋白不但可以再结晶，对IgG的吸附能力也比商用的免疫吸附剂高20倍。SbpA与增强的绿色荧光蛋白融合也可同时保持两种蛋白的特性，而被这种融合蛋白包被的脂质体经过2 h的孵育还可以进入HeLa细胞[23]。

5 结语

在过去的10年中，对S-layer的研究取得了巨大的进展，20世纪70年代早期，全世界只有不到5个实验室在关注S-layer，现在已有上百位研究者在300多种原核生物中发现了S-layer。通过对S-layer的合成、转运、组装、定位和功能进行深入的研究，发现这种在亚纳米水平上形成的具有相同理化性质的单分子多孔蛋白晶体在纳米技术上具有广阔的应用前景，而可与外源多肽融合表达并在细胞表面展示为有功能的融合蛋白的特性更为纳米生物技术开辟了新的领域。S-layer蛋白能在硅板上重新组装成连续的单层结构，并可以用深度超紫外激光放射固定，利用这一特点可将其用作有功能表面、已固定的仿生膜和可控制的生物矿化中的基质。随着研究的深入，S-layer蛋白的应用会越来越多。

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