免疫组化染色质量控制在乳腺组织切片中的应用

郭秀芳

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率占全身性肿瘤的 7%～10%,在女性仅次于子宫癌,已成为威胁女性健康的主要病因。本病的发病与遗传有关,绝经期前后的女性发病率较高,是一种通过发生在乳腺上皮组织严重影响女性身心健康,甚至危及生命的最常见的一种恶性肿瘤之一[1]。由于乳腺的主要成分是脂肪,易造成石蜡切片的不完整性,我们探索自己实验室的工作条件,及各种抗体的实验条件来控制标准化实验流程,稳定乳腺石蜡切片及其免疫组化染色的质量报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 来自本院临床近 2个月送检的乳腺标本,医用可调控 16寸高压锅,2 000 kW电炉。

1.2 要试剂 PBS液(pH值 7.4),第一抗体为兔抗人雌激素受体(ER),兔抗人孕激素受体(PR),兔抗人CerbB-2单克隆抗体,第二抗体为快捷免疫组化Elivision试剂盒,DAB试剂盒,均购自福建迈新公司。

1.3 组织切片的制片 乳腺标本经 10%中性甲醛充分固定后,取其中病变组织,经过梯度酒精充分脱水,二甲苯透明,58℃石蜡浸蜡,60℃石蜡包埋制成蜡块,一次性刀片进行切片,切片厚度为 2～3μm,40℃水温展片,水中可加适量的乙醇,因其有张力,使切片能充分展开,无折皱,用经 APES防脱片处理过的载玻片捞片。65℃温箱烤片 1～4h。

1.4 免疫组化染色方法 切片烤片后梯度酒精脱蜡至水,蒸馏水洗,PBS液浸泡 2 min×3次,3%的 H2O2溶液浸 5～10min,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS浸泡 2m in×3次,高压锅内放 PBS液,加热至沸腾,把切片置于耐高温塑料切片架上放入锅内,盖上锅盖,扣上压力阀,继续加热至喷气,从喷气开始计时 1～2m in,压力锅离开水源,冷却至室温,取出切片,我们用二步法使它不含生物素,可以避免由于生物素引起的非特异性背景染色,所以无需血清封闭内源性生物素,将修复后的切片用 PBS液洗 2次之后,滴加一抗工作液 37℃ 1 h,PBS液洗 2次后滴加二抗 37℃ 15～20m in,PBS液洗 3次后,DAB显色,复染,封片。

2 结果

乳腺组织切片无收缩开裂,组织结构细胞形态清晰,乳腺癌细胞及各种炎症细胞能清晰辨认,HE染色鲜艳,细胞核呈鲜明的蓝色,细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色,核仁呈红色,对比度良好,免疫组化染色的结果为病变组织结构完整,无脱片现象,阳性与阴性对比明显,阳性物质定位准确,背景干净清晰[2],无非特异性着色,细胞结构与细胞轮廓完整清晰,染色结果稳定可靠,敏感性高,特异性强,ER、PR在乳腺组织切片中细胞核呈深褐色,CerbB-2在乳腺切片中细胞核呈蓝色,细胞膜呈褐色,镜下呈环状表达。

3 讨论

免疫组化由于其具有复杂性,在技术应用过程中存在不少问题,直接或间接的影响了病理诊断,应予以重视以下几个方面,才能从总体上保证乳腺组织免疫组化染色的质量。

3.1 制作优质的石蜡切片是做好乳腺癌免疫组化染色的基础,组织固定的好坏是制作免疫组化结果的关键因素。乙醇脱水尽可能从较低浓度起始,以免组织过度收缩常温下二甲苯透明时间≤30min,不然组织变脆,制定严格按操作程序进行,否则是免疫组化产生假阳性[3]、假阴性或脱片的主要原因。

3.2 免疫组化切片的质量控制要求,免疫组化染色使用的玻片必须用饱和的重铬酸钾浓硫酸浸泡 3 d以上,捞出后用水来水彻底清洗干净,再用 95%的乙醇过一遍,晾干后涂防脱片剂烘干备用,裱片时切片片膜不能留有气泡,烤片时温度过低、时间过短,则易脱片,温度过高、时间过长则对抗原有破坏,烤片后专用二甲苯、乙醇脱蜡至水洗,脱蜡要彻底。我们曾采用水浴法等方法进行抗原修复,但效果不如高温高压抗原修复法理想[4]。另外高温高压加热时间的长短很重要,从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在3min内,时间过长,可能会使染色背景加深。PBS缓冲液不能重复使用,且容量必须保证所有切片都能浸泡到,整个染色过程不要让切片干涸。显色在镜下控制,时间约 3～7min,在阳性明确的部位着黄色即终止显色,此时显色程度较佳,能有效地避免背景着色。苏木素复染后要充分返蓝,否则背景呈紫红色。

3.3 增强特异性着色、降低非特异性染色是免疫组化的质量保证,抗体是免疫组织化学最核心的试剂,其质量直接影响免疫组织化学的结果判断继而影响诊断,由于乳腺癌组织中的淋巴细胞、脂肪细胞会产生非特异性染色,因此要选择特异性强,效价高的一抗,新购进的抗体储存在 4℃冰箱并进行预实验,摸索出最佳实验条件。抗体最好购即用型,以免在稀释过程中增加不必要的错误。防止失效的抗体进入实验室,此外要选择病变典型的做免疫组化染色对照,一定要每一批免疫组化均设有已知阳性对照和用 PBS代替一抗的空白对照。

3.4 免疫组织化学结果的判读,结果的判断免疫组化切片应是阳性标记强而非特异性染色淡或无,两者形成鲜明的对比,阳性表达必须在细胞或组织特定的部位,细胞边界清楚;每批染色都要有阳性对照、阴性对照和自身对照才能对染色结果作出正确判断。判断标准常根据阳性细胞的百分比或阳性细胞的染色深度来判断,其颜色深浅反映抗原量的多少。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。阳性反应分布总是有规律、局限、定位准确和一定形态特征的,如细胞膜着色呈圆形;典型的细胞核着色为均质状,核仁和染色质呈颗粒状着色。

3.5 免疫组织化学阳性库的建立。为了保证阳性对照的可靠性,在日常工作中要收集各种抗原的阳性组织和阳性切片,逐步建立阳性对照切片库及相应的电子档案库。如预期结果为阴性或病理形态诊断与免疫组化结果相反时,必须要有阳性对照才能作出正确的病理诊断,阳性对照能说明染色技术和阴性结果的可靠性,不是由于标本处理不当导致的抗原丧失、方法错误、技术不熟练等造成的假阴性。乳腺组织免疫组化染色步骤多、过程长、影响因素也多,因此只有在各个细节都认真对待,然后以常规的形式相对固定下来,才能确保其免疫组织化学结果的可靠性。

1 周丽梅,张斌.乳腺癌癌周浸润的病理组织学观察.临床外科杂志,2002,10：244.

2 张銘,司少艳,韩瑞刚,等.免疫组化 SP法与 PicTureTM两步法的比较.诊断病理学杂志,2004,11：58-59.

3 李向红.医学实验室标准化的方向.中华病理学杂志,2004,33：591-592

4 王力,杨举伦.高压锅水浴法修复组织抗原防脱片技术的应用.诊断病理学杂志,2002,9：161.