猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)诊断方法研究进展

邱美珍，傅胜才，周志雄 ，周望平，杜丽飞，王红兵，曾 胜

(1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131；2.湖南省桃江县高桥乡动物防疫站，湖南 桃江 413400;3.湖南农业大学，湖南 长沙 410128)

猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS)于1987年首先报道于美国，现已遍及全球主要养猪国家和地区。我国1995年首次暴发此病并从PRRS疑似病例中分离到PRRSV。目前根据临床和血清学调查，该病在我国普遍存在，而且近年来还呈流行态势，新的变异病毒株层出不穷，加之新老疫病交替感染，使生猪疫情越来越复杂，多病因混合感染导致疫病流行强度和危害程度显著增加，给养猪业造成毁灭性破坏，如何快速及时诊断PRRS成了畜牧业的研究热点。本文就临床诊断，血清学诊断和病原诊断研究进展作一综述。

1 临床诊断

1.1 临床症状

PRRSV可以引起各种年龄的猪群发生疾病，但是其表现各不相同，其中最为典型的两种临床表现就是母猪繁殖障碍和断奶仔猪呼吸系统疾病。同时该综合征又以急性、慢性、亚临床症状三种表现形式更为普遍。临床症状通常在感染后的2～7天表现出来，维持大约1周。

母猪感染后临床表现为发情期延迟、发情间期延长、受胎率降低、分娩率降低、厌食、发热、嗜睡、呼吸困难、呕吐、皮肤损伤与变色、早产（107～113天）、怀孕后期的流产、死胎、弱仔、木乃伊胎、无乳以及少数的死亡等；公猪感染了该病以后，精液品质和产量都有降低；哺乳仔猪感染后，表现的临床症状主要有快速的腹式呼吸、嗜睡、精神抑郁、断奶前死亡率增加、二次感染发病率增加；保育仔猪感染后，表现为快速的不正常呼吸、打喷嚏、厌食、被毛粗乱、行动迟缓以及偶尔的死亡。关于呼吸道症状，在临床上，许多感染猪有着严重的呼吸道症状，可是在实验条件下却很难复制呼吸道症状，这可能是由于PRRSV和细菌的脂多糖（LPS）产生协同作用，增强了感染猪只的呼吸道症状。

1.2 病理特点

PRRSV能引起猪只肺、胸腺、肝、扁桃体、脾、心、肾和淋巴结多系统感染，但是大体病变仅出现在几个有限的组织器官（即呼吸系统和淋巴组织），新生猪和哺乳仔猪感染的特征性病变和显微镜下病变最为明显。由于在野外的条件，PRRSV常常与一种或多种其他病原发生混合感染，病理变化更加复杂。新生猪和哺乳仔猪感染PRRSV后，肺呈红褐色，不塌陷。淋巴结肿大，呈褐色，成为诊断PRRSV的标志。在显微镜下，可以看到间质性肺炎。脑、扁桃体、淋巴结和心脏的显微镜下检查具有诊断学意义。还发现肺有不同程度的水肿，肺泡及肺泡膈水肿和炎性细胞浸润，大脑软脑膜及脑实质毛细血管淤血，透明血栓形成。

2 血清学诊断的方法

2.1 免疫过氧化物酶单层实验(IPMA)

1991年由Wensvoort等建立，至今仍是欧洲国家检测该病的常用方法。IPMA应用最早且使用广泛，敏感性与特异性都较好，可以用于PRRSV的抗原检测、病毒的鉴定、血清抗体的检测。实验主要在PAM、CL2621、MARC-145细胞上进行，能在感染后6日血清中检测到PRRSV抗体，具有较高的特异性。但是，该实验终点判断主观性较强，且不利于自动化操作，不适合大规模的检测。

2.2 间接荧光抗体试验（IFA）

由Yoon等于1992年首次报道建立的。可以用PAM、CL2621、MARC-145细胞培养物进行IFA。该方法与IPMA相似，特异性和敏感性都较好，并且简单易行，易于推广，可以在感染后2～3周检测出抗体，因此己经成为欧美各国官方认可的权威检测方法之一。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

由Albina等用PAM接种PRRSV培养制备阳性抗原，首次建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA。Takikawa等PRRSV接种MARC-145制备抗原，改进了检测PRRSV抗体的ELISA方法。Nodelijk G等比较了IPMA和ELISA方法用来检测PRRSV的效果，通过实验他们发现，IPMA能够比ELISA早2～3d检测出抗体，然而ELISA却能在不损失特异性的基础上提高敏感性，相比之下，ELISA更适合用来诊断PRRSV。目前，ELISA是检测PRRS最常用的方法之一，主要是因为该方法经济简便、检测结果快、重复性好、相对客观、能自动显示结果、可以大批量的操作，便于大规模的检疫。

2.4 血清中和试验（SN）

检测PRRSV特异性较好，但是中和抗体出现时间较迟，一般要在感染后4～6周出现。中和抗体比IFA抗体维持时间要长，一般可以维持半年以上，但是对于急性感染的敏感性较差，要求血清无污染，而且细胞培养工作量大，技术性强，目前仅仅限实验室研究应用。

2.5 乳胶凝集试验（LAT）

王忠利用纯化的PRRSV重组M蛋白致敏乳胶制成乳胶抗原，成功地将LAT用于PRRSV血清抗体的检测。LAT具有良好的特异性。用LAT与国外IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒同时对76份猪血清样本进行检测，结果表明LAT的特异性和敏感性均为95%，与IDEXX公司试剂盒的总符合率为87%，检出率基本一致。因LAT具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点，是一种适合基层兽医单位检测PRRSV血清抗体的新办法。

3 病原学的诊断

3.1 病毒抗原检测

检测病毒抗原主要有免疫组织化学技术、免疫金技术和免疫荧光抗体染色技术。Halbur等率先建立检测病猪PRRSV抗原的链酶亲和素-生物素-免疫过氧化物酶方法，是诊断该病的最准确的方法之一，也可以用于检测抗原的总体分布。Magar等报道使用特异性单克隆抗体建立了检测PRRSV抗原的免疫金银染色法（IGSS），人工感染实验表明该方法可于感染后几天之内从甲醛固定的感染组织中检测到PRRSV抗原，具有较好的特异性和敏感性。1992年Benfield等制备了抗PRRSV核衣壳蛋白的单克隆抗体，这种抗体能与北美洲和欧洲的45株分离株反应。表明该单抗是针对这些分离株的保守抗原决定簇，应用异硫氰酸荧光素（FITC）标记该单抗，建立了免疫荧光抗体技术并用于直接检测仔猪肺组织中的抗原。

3.2 病毒核酸检测

RT-PCR和原位杂交（ISH）均已成功用于PRRSV感染组织的和各种样品核酸的检测。Sur等以PRRSV的RNA为模板，应用地高辛标记法制备了特异性的cDNA探针，建立了检测PRRSV的RNA原位杂交技术。该技术可以确定病毒感染时的细胞和组织嗜性，特别适用于研究目的，但是技术含量高，难以用于临床的诊断。

RT-PCR现在己经广泛用于PRRSV实验室检测，是由Saurez等根据LV株的ORF7的序列，设计一对特异性的引物而建立起来的。研究表明，RT-PCR技术可以用于肺泡巨噬细胞、血清、血浆等样品的PRRSVRNA的检测。具有高度的特异性和敏感性，检测速度快，可检测到组织培养物及精液中30个PRRSV感染单位，敏感性是病毒分离的10倍。该法可以避免散毒的危险，尤其适合没有PRRSV感染的国家的检疫。对于一些特殊样品，如对细胞有毒性（精液）、已经灭活的样品、己被PRRSV抗体中和的样品和病毒含量很低的样品，使用RT-PCR技术检测是一种很好的方法。

3.3 病毒的分离

病毒分离是诊断该病最为准确的诊断方法。可从不同的组织器官中否可以分离到PRRSV病毒，最好采用死胎或者活产仔猪的肺、心、脑、肾、肝和脾等组织器官匀浆混合物，怀孕后期流产胎儿的血清也是很好的分离样品。血清和肺组织分离成功率最高，尤其是血清，因其采集方便，所以成为最主要的样本采集对象。另外，从猪群来看，最好是从保育猪和育肥猪采集病料进行病毒分离，因为PRRSV病毒的感染主要发生在这一时期。现在用于PRRSV的分离和体外大量培养的细胞主要有猪肺泡巨噬细胞（PAM）、非洲绿猴肾细胞传代细胞系CL2621和MARC-145（由MA104细胞进一步克隆而来）。PAM是PRRSV分离的最为敏感的细胞，MARC-145细胞对PRRSV具有高度的敏感性，可供多种毒株分离。不同毒株在不同的细胞上生长情况各不相同，有些毒株在第一代接种后需要3～5天才产生CPE，而有些则需要盲传几代后才能有CPE出现，还有些毒株即使在敏感细胞上也不能产生CPE。因此在进行病毒分离的同时，还应该结合IFA和IPMA等方法进行检测，从而使结果更加可靠。

4 结语

目前，临床上由于PRRS的症状复杂多样、无特征性症状，病变不明显、不典型，且常常继发、并发其它疾病，故临床诊断只能作为初步诊断。确诊需进一步采取病料进行病毒的分离鉴定、血清学和病原学诊断。虽然病毒的分离是诊断该病最为准确的方法，但是有时有些毒株即使在敏感细胞上也不能增殖，而且有些毒株仅仅只能在特定的细胞上才能增殖，这就使实验室诊断的可靠性也值得怀疑。因此，有效的诊断方法还有待进一步研究。

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