猪大肠杆菌卵黄抗体对仔猪黄痢疗效的研究进展

欧佐文 ，文 敏

（1.湖南农业大学动科院，湖南长沙410128；2.湖南省韶山市世源兽药厂，湖南 韶山411300）

猪大肠杆菌病是猪场中由致病性大肠杆菌引起，是危害仔猪生长发育的一种常见病和多发病。该病在仔猪的临诊表现也有不同，主要有黄痢型、白痢型和水肿型，仔猪黄痢尤为多见。其发病率已达到50%以上，死亡率超过56%。

随着抗菌药物的不断应用，细菌耐药性的问题已非常严重，应用常规药物和常规方法防治猪大肠杆菌病的难度越来越大，大肠杆菌病已经成为危害养猪业的重要疾病之一。国内外近年来对仔猪大肠杆菌病防治的相关研究，主要有:（1）研究新抗生素,；（2）应用中药进行防治；（3）应用益生菌进行预防；（4）研究耐药质粒消除剂；（5）研制大肠杆菌疫苗；（6）研制抗体药物；（7）利用外源抗体为仔猪提供被动免疫。从而预防和治疗肠道病原性大肠杆菌感染。

其中，猪大肠杆菌卵黄抗体因其化学性质稳定、特异性抗体含量高、安全性好、易规模化生产等特点越来越受到人们的注意，并有可能成为一种替代抗菌药物的高效生物药物。近年来国内外的研究结果也证明，应用卵黄抗体防治由致病性大肠杆菌引起的仔猪腹泻，能够取得比较满意的效果。

1 卵黄抗体特性及作用机理

自Klemperer于1893年首次报道鸡蛋中存在抗体并命名为卵黄抗体以来，人们对卵黄抗体的研究不断深入。卵黄抗体中存在的免疫球蛋白以IgY为主，IgA和IgM的含量极低。通过对母鸡进行特异性免疫来生产卵黄抗体，比从经特异性免疫的动物血液中获得的抗体具有突出的优点：（1）生产工艺简单，从经特异性免疫的动物采血不仅对动物本身造成严重应激，从而影响产量，而且操作麻烦。收集特异性免疫鸡蛋方便快捷，且可重复收取；（2）生产成本低廉，每只免疫蛋鸡可年产180～260枚蛋，每枚蛋中约含卵黄抗体90～210mg；（3）卵黄抗体较血清抗体稳定性更好，卵黄抗体比血清抗体对酸、碱、热更有耐受性，因而便利于运输及保存。预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体对宿主特异性菌毛抗原有强烈的亲和力，能在一定程度上降低宿主特异性菌毛与仔猪小肠上皮的结合，不利于致病性大肠杆菌在小肠黏膜定居增殖，阻断了大肠杆菌产生肠毒素，从而减少甚至防止仔猪发生腹泻。

2 预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体对仔猪腹泻的效果研究

尽管预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体的生产工艺不同，其机理都是通过特异性的卵黄抗体来阻断或降低大肠杆菌的宿主特异性菌毛与仔猪小肠上皮的结合，使其不能在消化道黏膜定居繁殖和产生肠毒素，从而防止腹泻的发生。饲料中添加少量的卵黄抗体，可以显著地降低仔猪腹泻率，并在一定程度上提高动物的增重、饲料转化率。

徐福洲等将致病性大肠杆菌标准菌株复壮、增殖、灭活而制备成大肠杆菌油乳剂苗,并应用该疫苗按一定的免疫程序免疫，在蛋鸡产蛋前一个月开始免疫，然后收集免疫鸡蛋，提取卵黄抗体并大致纯化后应用于猪大肠杆菌病动物模型口服治疗。试验表明，受治病猪腹泻症状显著减弱，与对照组差异明显。试验组动物未出现死亡而对照组动物死亡率高达67%。

还有的学者并不用大肠杆菌全菌来制备疫苗，而是应用分离纯化的大肠杆菌菌毛蛋白制备成疫苗，将该疫苗多次接种蛋鸡，并收取免疫鸡蛋制备卵黄抗体。将卵黄抗体喷雾干燥后，应用其对不同大肠杆菌菌株感染的腹泻仔猪进行治疗。结果显示，用间接ELISA效价为1∶625和1∶2500的卵黄抗体治疗的两组仔猪全部存活，而对照组仔猪的死亡率达到80%。Yutaka等应用致病性大肠杆菌标准菌株的K99菌毛蛋白制备免疫原接种蛋鸡后收取免疫鸡蛋并制的卵黄抗体，当稀释至间接ELISA效价为1∶1600时，仍能够有效治愈仔猪腹泻，且能提高仔猪的日增重。Kim等曾分别以大肠杆菌标准菌株K88菌毛和全菌制成疫苗接种蛋鸡而制的卵黄抗体，并对两种工艺所制的卵黄抗体的效价进行了比较，结果显示前者的效价显著高于后者。国内学者也将由菌毛免疫和菌株免疫两种不同工艺制备的卵黄抗体对猪大肠杆菌病的疗效进行了比较。肖驰等的试验显示：两类卵黄抗体都能有效地预防和治疗仔猪大肠杆菌性腹泻，但以菌毛K88制备疫苗免疫蛋鸡制备的卵黄抗体对猪大肠杆菌病预防和治疗效果更好。

另外，有的学者还用多种血清型的大肠杆菌制的多价菌苗接种蛋鸡制备卵黄抗体，也显示出较好的临床应用效果。李学伍等的试验结果表明，应用多种血清型大肠杆菌制备多价大肠杆菌疫苗免疫蛋鸡，从而制备出的卵黄抗体对腹泻仔猪的治愈率最高可达97.7%，比抗菌药物对腹泻仔猪治疗的治愈率高21.2%。不仅如此，在制备大肠杆菌多价苗选择制苗菌株时，选用大肠杆菌地方株更优于选用大肠杆菌标准菌株。Marquardt等选用大肠杆菌地方株的菌毛抗原（K88+）接种蛋鸡制备的卵黄抗体，对新生和断奶感染致病性大肠杆菌的病猪不仅有较好的治疗效果，而且对提前断奶的仔猪感染致病性大肠杆菌也有较好的疗效效。腹泻的3日龄仔猪，在用卵黄抗体拌料饲喂后24h被治愈，而用未免疫猪大肠杆菌疫苗蛋鸡的蛋黄粉拌料饲喂的对照组，仔猪腹泻无任何好转甚至更加严重，最后，对照组腹泻仔猪不断因严重腹泻而死亡，死亡率达到62.5%。

3 应用基因工程技术表达大肠杆菌菌毛抗原用以制备卵黄抗体的研究

在已有的公开报道中，致病性大肠杆菌菌毛抗原的基因已经得到充分研究，完全可以利用基因工程技术来大规模生产致病性大肠杆菌菌毛抗原。这主要是由于原核表达中的工程菌（如大肠杆菌和酵母菌等）对目的基因的表达调控机制相对简单和生长速度较快，因而可以快速超量合成在其它生物体内含量极微但却具有较高经济价值的生物活性物质。

由于表达产物的提取纯化技术的长足发展，应用基因工程技术表达目标抗原用以制备卵黄抗体的生产加工也已趋于工业化。如今，超过上百种生物活性蛋白抗原通过原核表达基因工程从而实现了对它们进行产业化生产，如富含半胱氨酸残基的血清白蛋白、尿激酶原和金属硫蛋白等。Mooi FR等构建成功含有K88ab抗原基因重组质粒pFM205，转化后获得重组菌株能特异性地与抗K88ab的血清抗体结合，形成抗原抗体复合物。洪孟民等成功研制出能超量表达致病性大肠杆菌K88基因的工程菌。国内张景六等成功构建携带K88、K99两种菌毛抗原基因的双表达载体，其表达产物可为预防不同血清型致病性大肠杆菌引起的仔猪腹泻提供了广谱的生物药物制剂。吴雅旭等为了超量表达致病性大肠杆菌K88ac蛋白，应用强启动子构建新型表达，转化后获得的新型K88ac抗原基因工程菌株对菌毛抗原表达效率为原K88ac抗原基因工程菌株的16倍。

随着基因工程技术的不断发展，以及新启动子的不断创建和DNA重组载体系统研究的不断深入，利用基因工程技术来构建高效、稳定的原核表达体系指日可待。构建超量表达致病性大肠杆菌菌毛蛋白的载体，从而获得超量表达致病性大肠杆菌菌毛蛋白的菌株，提高致病性大肠杆菌菌毛抗原的产量，降低生产防治猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体的免疫抗原的生产成本，从而大大降低卵黄抗体的生产成本，为这一替代抗菌药物的新型饲料添加型生物药物制剂在仔猪大肠杆菌性腹泻防治中的广泛应用确立了坚实的技术基础。 □

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