超临界CO2萃取麦冬中高异黄酮类物质的工艺研究

曾品涛，郑一敏，胥秀英，傅善权，胡 杨，李 杰

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400050)

麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬Ophiopogonjaponicus(L.) Ker－Gawl.的块根，其化学成分主要有甾体皂苷、高异黄酮、多糖、氨基酸、挥发油等[1]，其中高异黄酮具有多种生理活性。麦冬中 R－甲基沿阶草酮A和B等高异黄酮类对HeLa－S细胞有较强的细胞毒性[半数抑制量(IC50)低于10μg/mL][2]。对豚鼠给予甲基麦冬黄烷酮A或B(30mg/kg)，对因辣椒引发咳嗽的抑制率为49.7%[3]。但目前关于麦冬黄酮类化合物提取工艺的文献报道较少，且采用的溶剂提取法存在溶剂消耗量大、生产周期长等问题。采用超临界萃取(supercritical fluid extraction，SFE)技术提取黄酮类化合物，具有工艺流程短、萃取效率高、萃取分离一步完成等优点，但利用超临界CO2萃取麦冬中高异黄酮类物质尚未见报道。麦冬中的黄酮类物质大多数为高异黄酮苷元，极性较小，适宜采用超临界CO2萃取法。

1 仪器与试药

TC－SPE－50－0.5－210S型0.5 L超临界萃取装置(沈阳天诚超临界萃取有限公司)；TU－1901型双光束紫外可见光分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；GFN－14型电动微型粉碎机(四川自贡市渐飞机械厂)；BuCHIRotavapor R－124型旋转蒸发仪(瑞士BuCHI公司)；KQ－50型超声波清洗器(昆山市超声波仪器厂)；SHZ－C型循环水式多用真空泵；AE200S型电子天平(梅特勒－托利多仪器＜上海＞有限公司)。麦冬为四川绵阳栽培品种，经本院傅善权副教授鉴定为川麦冬 Ophiopogon japonicus(L.)Ker－Gawl.的干燥块根)；二氧化碳(重庆朝阳气体厂，纯度不低于99.5%，食品级)；6－甲酰基沿阶草酮甲标准品(上海海灿生物技术有限公司)；95%医用乙醇；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 麦冬总高异黄酮含量测定

2.1.1 溶液制备

精密称取6－甲酰基沿阶草酮甲标准品适量，加95%乙醇制成质量浓度为1.32μg/mL的对照品溶液。称取超临界萃取干燥物约71.35mg，称定精密，加95%乙醇定容至10 mL，超声处理，过滤，作为供试品溶液，备用。

2.1.2 测定波长确定

精密吸取对照品溶液和供试品溶液适量，在200～400 nm波长范围内扫描。结果供试品溶液与对照品溶液在290 nm波长附近均有最大吸收峰，故确定测定波长为290 nm。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取对照品溶液0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL，分别置10mL量瓶中，用95%乙醇稀释，定容，于290 nm波长处测定吸光度，以对照品质量浓度 X(μg/mL)对吸光度 Y进行线性回归，得回归方程 Y=0.052 92X+0.067 76，r=0.999 4(n=6)。结果表明6－甲酰基沿阶草酮甲质量浓度在5.28～11.88μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：精密移取对照品溶液6份，各0.5mL，置10mL量瓶中，超声定容，依法测定。结果吸光度平均值为0.415，RSD= 0.86%(n=6)。

重复性试验：称取同一批超临界萃取物6份，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，再分别精密移取100μL，按线性关系考察项下方法操作。结果吸光度平均值为0.63，RSD=1.43%(n=6)。

稳定性试验：分别精密移取同一供试品溶液100μL，按线性关系考察项下方法操作，每间隔20min测定1次。结果吸光度平均值为0.579，RSD=1.35%(n=6)。

加样回收试验：称取已知含量麦冬粉末6份，每份加入适量对照品，进行超临界CO2萃取，按2.1.1项下方法制备待测溶液，按线性关系考察项下方法操作，测定吸光度，代入回归方程计算含量。结果平均回收率为98.75%，RSD=0.62%(n=6)。

2.2 正交试验

以总高异黄酮含量为评价指标，将萃取温度(因素A)、萃取压力(因素B)、萃取时间(因素C)、夹带剂量(因素D)作为考察因素[4]，采用L9(34)正交表进行试验，平行3次，取平均值进行分析，因素水平表见表1。将麦冬于50℃干燥12 h，粉碎(40～60目)。准确称取粉末100g，置萃取釜中，设定分离器Ⅰ压力为6～7MPa，温度为35℃，分离器Ⅱ压力为4～6MPa，温度为35℃。选用乙酸乙酯、95%乙醇混合溶剂(2∶1)作为夹带剂，CO2流量控制在4.8 kg/h。将萃取液过滤、干燥，按2.1.1项下方法操作，测定吸光度，计算出萃取率。结果见表2。直观分析显示，总高异黄酮提取率的影响因素大小顺序为B＞C＞A＞D，最佳试验条件为 A2B2C3D3，即萃取温度55℃，萃取压力20MPa，夹带剂2.0mL/g，萃取120min。

表1 因素水平

表2 正交试验结果

2.3 最佳工艺验证试验

按照正交试验最佳工艺条件进行试验，装料100g和125g，分别重复3次。结果总高异黄酮的平均萃取率为1.67‰，RSD为1.69%(n=3)。

3 讨论

萃取率随萃取温度的升高而增大，55℃时达到最大。其原因可能是麦冬中的多糖含量较高，达到95%～98%[5]。试验过程中发现，温度对麦冬粉末的黏度影响较大，黏度在一定范围内能够增强溶质与溶剂的传递效应，但黏度过大时则会起到相反作用。

麦冬中的高异黄酮类物质极性较小，易溶于乙酸乙酯，能溶于正己烷。单独采用95%乙醇作夹带剂，体积达到3.0mL/g时仍不能达到最佳萃取率；单独采用乙酸乙酯作夹带剂时，接样时萃取液极易气化，损失严重。预试验结果显示，95%乙醇与乙酸乙酯比例为2∶1时，萃取率最大。

本试验中，采用超临界CO2萃取工艺，麦冬中总高异黄酮的含量可达0.167%，明显高于溶剂提取法的含量[6－7]。目前麦冬黄酮的含量测定均采用橙皮苷或芦丁为对照品，与麦冬中的主要黄酮类物质高异黄酮在结构上存在一定差异，紫外吸收光谱差异较大。本试验中采用6－甲酰基沿阶草酮甲为对照品，能更加精确地测定麦冬中高异黄酮的含量。

[1]林 晓，周强峰，徐德生.麦冬药理作用研究进展[J].上海中医药杂志，2004，38(6)：59－61.

[2]怡 悦.麦门冬的细胞毒性成份[J].国外医学·中医中药分册，1999，21(5)：42－43.

[3]Kamei A，Ichiki H.Antitussive agents and pharmaceutical compositions containing methylophiopogonanone[P].CODEN：JKXXAFJP 2003327529 A2，2003－11－13.

[4]时海燕，徐春波.浅析影响中药超临界CO2萃取的因素[J].西北药学杂志，2008，23(2)：120－122.

[5]肖培根.新编中药志(第1卷)[M].北京：化学工业出版社，2002：482.

[6]杨清林，顾月翠，姜荣兰.川麦冬及其炮制品总黄酮和微量元素的比较[J].华西药学杂志，1995，10(2)：77－78.

[7]宋金春，曾本富，蔡鸿生.麦冬不同炮制品中总黄酮含量分析[J].中药材，1989，12(12)：34.