氯霉素的不良反应及其残留检测方法研究进展*

高 林

(通标标准技术服务(上海)有限公司,上海 200233)

氯霉素(chloramphenicol,CAP),分子式为C11H 12 C12 N2 O5,于 1947年从委内瑞拉链霉菌(Streptom yces venezuela)的培养滤液中分离出的结晶性抗菌素。氯霉素的脂溶性高,可通过弥散进入细菌细胞内,可逆地结合在细菌核糖体的50 S亚基上,阻断转肽酰酶的作用,干扰带有氨基酸的胺基酰-tRNA终端与50 S亚基结合,使肽链增长受阻,抑制肽链的形成,从而阻止蛋白质的合成。氯霉素也可与70 S核糖体进行可逆性结合,抑制线粒体的蛋白合成,对人体产生毒性。因此氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视,欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零允许量”[1]。

氯霉素残留检测方法的建立始于20世纪70年代,随着新技术的不断出现,氯霉素的检测方法有很多种,可分别为微生物法、化学分析法、免疫学检测法及其他分析方法。

1 氯霉素的不良反应

1.1 对血液系统的影响

氯霉素可引起骨髓造血机能紊乱。一是可逆性的引起各类血细胞减少,可引起血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏症,并且与药物的剂量有关;二是不可逆地引起再生障碍性贫血,发生较晚但极为严重,死亡率高,与剂量疗程无直接关系。氯霉素引起的严重骨髓损害者中少数幸存者可能逐渐发展至粒细胞性白血病。

1.2 灰婴综合症

由于早产儿及新生儿的肝内酶系统发育尚不完全,葡萄糖醛酸结合的能力较差,使氯霉素的代谢、解毒过程受限制;应用大剂量氯霉素后血药浓度异常增高引起婴儿的循环衰竭(灰婴综合症),偶尔也发生在低剂量治疗时。此外,由于早产儿及新生儿的肾脏排泄能力亦较弱,容易引起药物蓄积中毒。

1.3 对神经系统的影响

氯霉素可引起中毒性精神病,主要表现为幻视、幻听、定向力丧失、精神失常等。偶可引起视神经炎、多发性神经炎、球后视神经炎及视力障碍,神经性耳聋以及严重失眠,并发展至视神经萎缩和失明。

1.4 变态反应

少数患者可出现皮疹、药物热及血管神经性水肿等过敏反应,直接接触氯霉素可发生接触性皮炎或接触性结膜炎。

1.5 其他

口服氯霉素可以引起消化道症状和口部症状,如食欲减退、恶心、腹泻以及口角炎、口腔苦味、口腔黏膜充血、疼痛、糜烂、舌炎等。

2 氯霉素残留检测方法

2.1 微生物法

微生物检测氯霉素法可大体分为两类,一类是基于抗生素对微生物的抑制作用,如样品中含有残留的抗生素,则对培养基中的细菌产生抑菌圈,根据抑菌圈的有无及大小来判定结果,采用不同的实验菌,可检测不同的抗生素残留,主要有棉签法、杯碟法、纸片法、TTC法、戴尔沃检测、BY法等;另一类是由于微生物对氯霉素敏感而引起生化特性的变化,如氯霉素对发光杆菌的抑光作用,通过检测发光强度的变化来检测氯霉素的含量。

2.1.1 杯碟法 样品经处理后,注入牛津杯中,与含菌液的鉴定平板贴合,培养后,根据抑菌圈有无及大小判定结果。采用不同的试验菌种,可检测不同的抗生素。研究表明,此法检出限为0.25μg/g;氯霉素浓度在0.25μg/g～1.00μg/g时平均回收率为67.5%。该方法的灵敏度比棉签法高,但要进一步提高灵敏度很困难。

2.1.2 棉签法 棉签法,又称现场拭子法,是检测动物体中抗生素残留的现场试验方法。该方法是用棉签采集动物体内的组织液,然后将其放置于涂满枯草杆菌的培养基中保温过夜。根据棉签周围的抑菌圈有无以及大小来判断抗生素残留。

2.1.3 TTC法 在样品中加入嗜热链球菌经培育2.5 h～3 h后,加入 40 g/LTTC(三苯基四氮唑)指示剂水浴培养30 min,颜色不发生变化为阳性;如果样品呈红色则为阴性。该法费用低,操作简单,缺点是易出现假阳性。

2.1.4 戴尔沃检测法 原理是利用微生物-嗜热芽胞菌在64℃条件下培养2.5 h～3 h后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素,嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸,指示剂将不变色。该法具有操作方便,容易判断,结果可靠,费用适中等优点,但也易出现假阳性。

2.1.5 蓝黄检测法(BY法) BY法是一种广谱的微生物抑制法,能在较短的时间里检测到样品中抗生素的残留,通过颜色的对比判断阳性、阴性和可疑样品。此方法耗时短,操从简单,检测抗生素种类较多,但误差较大,容易误检。

2.1.6 发光细菌法 Shakila R J等[2]报道了一种改进的微生物法检测虾组织中氯霉素的含量,该法是利用从墨鱼中分离得到的一株鱼发光菌(P.leiognathi L-2),在氯霉素存在的条件下,其生长受到抑制并产生抑制圈,根据抑制圈的直接大小判断氯霉素的残留量。该法的检测限为1μg/kg,回收率高达95.63%。

王亚群等[3]建立了另一种发光细菌(P.leiognathi YL)检测氯霉素残留的新方法,该法利用氯霉素对鳆发光杆菌发光的抑制作用,通过光强的变化检测氯霉素的含量。线性范围为0.1 ng/mL～1.0 ng/mL,相关系数R为0.989,该法具有成本较低,操作快速简单,检测限低的优点,最低检测限为0.1 ng/mL,可以作为水产品中痕量氯霉素残留的一种快速、灵敏的检测方法。

2.2 免疫分析法

免疫分析法是以抗原与抗体特异性、可逆性结合反应为基础的一类常用分析方法。由于氯霉素是半抗原,不能刺激机体产生抗体,可将氯霉素的二氯酰胺醇和硝基苯结构和大分子蛋白结合后均可作为完全抗原有效制备相应的抗体,在此基础上建立酶联免疫竞争法测定氯霉素含量,常用的有酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫法(RIA)、固体免疫传感器、化学发光酶免疫法(CLEIA)等。

2.2.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA的原理是试样中残留的CAP与试剂盒中的CAP酶标记物共同竞争CAP抗体,形成有酶标记或无酶标记的抗原抗体复合物而被吸附于微孔板底,用酶标仪在450 nm处测定吸光度,根据吸光度值得出样品中CAP的残留量。此方法简单、快速、灵敏度高、重复性较好,适用于大规模CAP的残留筛选检测。Wesongah JO等[4]用竞争性酶联免疫法检测红马赛羊血液中的氯霉素残留,检测限为0.1 ng/mL。

目前市场上有多种氯霉素检测试剂盒供应。陈雪昌等[5]报道了采用德国R-Biopharm公司的 RIDASCREEN氯霉素试剂盒检测虾肉中的氯霉素残留方法,该法平均检测下限为0.0125μg/kg,回收率为88.1%～94.4%,RSD为2.98%～6.67%。美国IDS公司2009年3月新上市了一步法快速氯霉素ELISA试剂盒,是目前市面上操作时间最短的产品,反应在包被了氯霉素抗体的固相微孔板上进行,采用抗体直接包被微孔的一步法反应方式,检测时间为20 min,检测下限为0.1 ppb。但是ELISA的缺点在于影响因素较多,易出现大量假阳性结果。抗体批次不同,测定结果也会出现差异。

2.2.2 免疫胶体金法 免疫胶体金技术是20世纪80年代发展起来的一种新型免疫标记技术,应用该技术制成的胶体金试纸条具有简便、快速、灵敏、特异性高等优点,但其稳定性及灵敏度尚待进一步提高,且不宜定量。李余动等[6]建立了胶体金免疫层析试纸条法快速检测虾肉等组织试样的氯霉素残留,灵敏度最低值可达到1 ng/mL,只需5 min～10 min。王玮等[7]制备了平均粒径20 nm的胶体金标记抗氯霉素多克隆抗体;将氯霉素半抗原与卵清蛋白的偶联物包被在硝酸纤维素膜上作为检测带,羊抗兔二抗作为质控带,依据免疫竞争法原理,建立通过免疫胶体金渗滤式试纸条检测六种淡水鱼及牛乳中氯霉素残留的方法,样品前处理方法简便,方法灵敏度为1μg/L。

2.2.3 CHARM Ⅱ CHARM Ⅱ检测氯霉素残留试剂盒为美国 FDA推荐使用的检测仪器,由美CHARM Science公司研制生产的第2代产品。此法的基本原理是将免疫抗体溶于水后,加入含氯霉素的样品中,在一定的孵育温度下,样品中的氯霉素与受体位点结合,再加入H I标记的氯霉素抗原与多余的受体位点结合,孵育一段时间后离心沉淀,取沉淀物加闪烁液,用CHARM Ⅱ分析仪测定荧光强度,样品中氯霉素残留量与荧光强度成反比。对于鱼组织中氯霉素残留量的检出限可达0.15μg/kg,但同样存在假阳性结果的问题。

2.2.4 放射免疫法 A rnold D等[8]建立了放射免疫分析检测方法,该方法灵敏度高,最低检测限为200 ng/kg,但该法具有同位素半衰期短、存在放射性污染及需要复杂仪器设备等缺点,应用范围受到限制。陈小雪等[9]建立CharmⅡ放射免疫系统测定水产品中氯霉素残留的分析方法,用CharmⅡ检测氯霉素残留试剂盒中的MSU萃取缓冲液,对样品中的氯霉素残留进行提取,通过竞争性受体免疫反应,采用液体闪烁计数仪计数。cpm读数的相对标准偏差为2.4%～8.8%。

2.2.5 化学发光酶免疫法 化学发光酶免疫分析(CLEIA)是一种采用化学发光剂做为酶反应底物的酶标记免疫测定的方法,常用的标记酶有两种即辣根过氧化物酶(H RP)和碱性磷酸酶(AP)。胥传来建立了化学发光酶免疫检测方法(CLEIA)检测对虾组织中CAP的残留,检测灵敏度可达到0.01μg/L;检测范围为0.03μg/L～23.7μg/L。高彬文等[10]利用化学发光酶联免疫法检测鱼虾中氯霉素残留,检测限为5.8×10-4μg/kg。该法灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、仪器简单、不需复杂的样品前处理过程等优点,但ECLIA法对实验条件的要求较高,其稳定性及敏感性尚待进一步提高。

2.2.6 伏安免疫法 Song W W等[11]建立了以间接竞争ELISA为基础,A LP为标记酶,pNPP底物,伏安法为检测法的伏安免疫分析体系,该方法检测CAP的检出限为 0.064μg/L,检测线性范围为0.15μg/L～600μg/L,与传统的ELISA法相比,此法灵敏度高、特异性强,操作简单,但汞易挥发且有毒,同时滴汞电极上的残余电流较大,限制了测定的灵敏度,分辨率低。

2.2.7 免疫芯片法 Gao Z X等[12]报道了同时检测氯霉素、罂粟碱等5种化学物质的免疫芯片法。该法以牛血清蛋白做封闭剂,经过活性酯反应、戊二醛反应、氯甲酸异酯反应、混合酸酐反应、亚胺反应和重氮化反应,将CAP合成为CAP-BSA蛋白结合物,经过Sephadex G-25纯化后,用Cy3荧光染料标记(CAP-BSA-Cy3),固定在醛基化玻片上的特异性抗体为探针,通过特异性抗原抗体反应计算氯霉素的含量,在CAP水平为0.001μg/mL～5μg/mL范围内,R2＞0.99,RSD＜10%。免疫芯片法的优点是灵敏度高,速度快。

2.3 色谱技术

色谱方法可检出样品中的痕量污染物,具有检测限低、精确度高等特点,是水产品中CAP残留检测的最有效的一类方法,但缺点是操作复杂、时间长、成本较高。在氯霉素残留检测方法上正在由各种分析技术联用代替单一的色谱技术,目前检测氯霉素常用的色谱法包括液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)、气相质谱联用法(GC-MS)、液相质谱联用法(LC-MS)、气相色谱电子捕获检测器(GC-ECD)等。

2.3.1 LC法 高效液相色谱法检测氯霉素是一种灵敏度较高、可靠性较强的一种方法,此法不需衍生化步骤、样品处理程序较为简单、重复性好、假阳性少,但检出限较高,为5μg/kg～10μg/kg,回收率偏低,处理过程复杂、分析速度慢等缺点。

黄志勇等[13]建立了采用高效液相色谱(HPLC)检测养殖水产品中氯霉素残留的方法,样品经乙酸乙酯提取2次后,再通过净化和浓缩处理,以甲醇∶水(35∶65)为流动相进行HPLC分离氯霉素组分并于278 nm下测定其色谱峰信号,在50μg/mL～1 000μg/mL范围内,线性关系 R2=0.999 4,检出限为14μg/kg。平均加标回收率为93.2%,RSD小于5%。

Chen H X等[14]报道了用液相色谱可变波长检测器(LC-VWD)检测蜂蜜中的氯霉素的残留,该法通过将30μL四氯乙烷萃取液和1 mL乙腈分散剂混合液注入到5 mL的蜂蜜中进行萃取,氯霉素位于四氯乙烷层,离心沉淀后,用液相色谱可变波长检测器进行检测,在30μg/kg～2 000μg/kg范围内成线性关系,浓缩因子为68.2,S/N=3时,最低检测限为0.6μg/kg,RSD为4.3%,该法拥有回收率高、重复性好、快速、高浓缩因子等优点。

2.3.2 GC法 利用气相色谱法检测氯霉素的优点是高分离效能、检出限低、灵敏度高,但需要衍生化,过程繁琐,易出现假阳性。白艳玲等[15]报道了用ECD-气相色谱仪测定水产品中氯霉素残留。该方法用乙酸乙酯提取水产品组织中的氯霉素,浓缩后用含NaC1的正己烷抽提脱脂,样液经C18固相萃取小柱净化,BSTFA+TMCS衍生化,最后进样检测。回收率在 86.3%～95.3%,最低检出浓度达到0.02 ng(S/N=3),线性范围为 2.5 ng/mL～5 000.0 ng/mL,相关系数r=0.999 5,相对标准偏差为5.02%～9.04%。该方法具有灵敏度高,样品提取简单等特点。Cerkvenik-Fajs V等[16]报道了采用气相色谱电子捕获器(GC-ECD)检测动物肌肉组织中氯霉素的残留,用氯霉素的异构体作为内标,r=0.999 1,最低检测限为0.07μg/kg,该法重复性好,假阳性少。

2.3.3 联用技术 联用技术可扬长避短,一般兼分离、定量和定性于一体。常见的联用技术有LCMS、LC-ESI-MS/MS、CEIA-LIF、GC-NCI/MS、SFC-MS 、CZE-MS 、LC-NMR 等 。

LC-MS是美国FDA推荐使用的氯霉素确证方法,其灵敏度较荧光检测器高1个数量级,能方便地对ng/kg级的残留组分进行检测与结构确证。

林海丹等[17]报道了水产品中氯霉素药物残留的LC-MS/MS分析方法,该法测定检出限0.1μg/kg,回收率为 95%～110%。Zhang S X等[18]采用LC-MS检测鸡肉组织的中残留的氯霉素,样品通过乙酸乙酯抽提、己烷脱脂、Oasis MCX固相小柱净化,然后以流速为0.20 mL/min的乙腈水进行梯度洗脱分离,然后在多反应检测下进行电喷雾质谱检测。该法检测CAP的最低检测限为0.1μg/kg,线性范围为 0.3μg/k～ 20μg/kg,回收率为95.1%～107.3%,RSD＜10.6%。

Zhang C等[19]报道了利用毛细管电泳激光诱导荧光免疫法(CEIA-LIF)检测动物源食品中的氯霉素的残留量,当添加水平为0.008m g/L～5 mg/L时成线性关系,最低检测浓度(LOD)高达0.001 6mg/L,该法快速、简便、灵敏,是普通ELISA的20倍。

Shen JZ等[20]用气相色谱-负化学离子源-质谱(GC-NCI/MS)联用技术检测家禽的肌肉以及肝脏组织中的CAP的残留。样品组织通过乙酸乙酯抽提、己烷液液萃取、Oasis H LB固相小柱净化,再用BSTFA+1%TMCS分离目标物,在负化学源(NCI)选择离子检测(SIM)操作模式下,进行GC-NCI/MS检测。该法的回收率为78.5%～105.5%,RSD＜17%,CAP的最低检测浓度为0.1μg/kg。

2.4 其他方法

2.4.1 高通量悬浮点阵技术(suspension array technology) 悬浮点阵技术是一项液相基因型分析方法和荧光标记的微珠捕获过程相结合的新技术,Liu N等[21]报道了同时检测CAP、克伦特罗和17-β-雌二醇3种兽药的高通量悬浮点阵技术。方法中用牛血清蛋白(BSA)对CAP进行CAP-BSA复合物螯合,带荧光标记的微珠上的羧基与BSA上的氨基进行连接从而将 CAP固定在微球上,特异性的mAbs抗体对CAP-BSA复合物进行捕获,通过添加不同浓度 mAbs产生荧光强度变化,从而计算出CAP的含量。CAP的检测范围为 0.04μg/L～625μg/L,R2＞0.989;该法具有高通量,多功能性,灵活性,准确性和重复性。

2.4.2 表面电浆共振法(surface plasmon resonance,SPR) 表面电浆共振是一可用于测量介面附近光学特性变化且具有高灵敏度的检测方法,有极高的灵敏度,无须标定(label-free)的优点更胜于一般的萤光检测技术、色相层析法。Dong Z等[22]报道了一种基于SPR系统的用于小分子无标实时检测食品中氯霉素残留的分子检测技术,主要原理是特异性分子间的相互作用和间接竞争免疫反应,该法灵敏度高,最低检测限为0.5 ng/mL。

2.4.3 分子印迹基质固相分散(M I-MSPD) 基质固相分散(MSPD是近几年发展起来的一种新的样品前处理技术,对固体、半固体或黏性液体样品中目标物质分析具有独特的特性,在现代农药残留分析中应用越来越广泛;同时分子印迹聚合物(M IP)的预见性、识别性和实用性三大特点以及其廉价的成本应用于复杂基体的微量痕量分析有着十分广阔的前景。陈翠玲[23]报道了采用分子印迹技术结合GC检测虾肉组织中氯霉素残留,该法以氯霉素作为模板分子,丙烯酞胺为功能单体,乙二醇二乙酸酯为交联剂,偶氮二乙丁氰作引发剂,采用热聚合和光聚合的方法聚合。当氯霉素的浓度为0.005μg/mL～0.1μg/mL,r=0.987,回收率为92.0%～120%,检测限为0.5μg/kg。

Guo L Y等[24]也报道了利用分子印迹技术合成对氯霉素有特异吸附作用的分子印迹聚合物作为固相萃取柱的固定相结合HPLC法检测鱼组织中氯霉素残留的方法,该法的最低检测限为1.2 g/kg。

2.4.4 溶胶免疫色谱法 Stidl R等[25]报道了利用溶胶凝胶柱上的特异性抗CAP抗体吸附样品中的CAP来预处理虾组织,然后采用HPLC检测CAP的含量,回收率为68%,RSD＜4%,该法的优点是消除了基质干扰,特异性强,缺点是灵敏度低。

2.4.5 伏安电化学法 Agui L等[26]报道了用电化学活化碳纤维微电极检测牛奶中氯霉素的含量的伏安法,线性范围为0.032μg/mL～0.32μg/mL,r=0.999,最低检测限为0.015μg/mL。Xiao F等[27]采用由单壁碳纳米管、纳米金颗粒和离子溶液构成的复合膜修饰玻碳电极的伏安法测定氯霉素含量,该法线性范围为 0.032μg/mL～19.2μg/mL,最低检测限为1.6μg/mL×10-3μg/mL。电化学法与其他方法比较有着快速、低成本、灵敏度高等优点。

3 结语

用于检测氯霉素残留还有很多其他分析方法,如超临界流体色谱(SFC)、扫面示波、毛细管区域电泳(CZE)、氯霉素乙酰转移酶突变体检测等。总之,基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高,特异性强,试样预处理简单,分析时间短,现在已出现一些试剂盒产品,使用方便;色谱方法可检出样品中的痕量污染物,具有检测限低、精确度高等特点,但是存在着操作复杂、时间长、成本较高的问题;同时一些新的生物学方法也不断得以研究开发,如发光细菌检测氯霉素、氯霉素乙酰转移酶突变体检测等由于具有操作简便、灵敏度高等优点也逐渐得到运用。

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