黄瓜转基因技术体系及相关基因转化研究进展

魏爱民，杜胜利，韩毅科，张桂华，刘楠，崔兴华

（天津科润公司黄瓜研究所，300192）

黄瓜是我国主要的蔬菜作物之一，是我国保护地栽培面积最大的蔬菜作物。黄瓜在生长过程中极易遭受各种病虫害及不利环境的影响，黄瓜的产量和品质大大降低。选育优良品种是解决这些问题的关键，但由于现有种质资源的限制，采用常规育种方法很难在一些性状上有大的突破。随着生物技术的发展及其在农业领域的广泛应用，应用基因工程技术有目的地改良性状，特别是采用常规育种方法无法改良的性状，创造黄瓜育种新种质，为黄瓜育种技术的创新提供了新的途径。

黄瓜的遗传转化研究始于1986年，经过20多a的发展，研究者在黄瓜再生体系、转化技术体系等方面进行了大量研究，针对不同目的基因，对转基因植株及后代性状进行了详细研究，相关研究报道较多。作者从黄瓜离体体细胞再生体系、转化方法、目的基因等方面归纳整理了国内外黄瓜转基因研究进展，并比较国外黄瓜转基因状况，分析了我国黄瓜转基因研究中存在的问题，现综述如下。

1 再生体系

高效、稳定的再生体系是农杆菌介导的黄瓜遗传转化技术的基础。黄瓜离体体细胞再生研究始于1979年，根据再生芽产生方式的不同，黄瓜离体体细胞再生体系可分为以下两种：器官发生途径和胚状体发生途径。胚状体发生途径因为再生频率较低，较少采用；多数黄瓜离体体细胞再生体系均采用器官发生途径。

基因型、激素种类及配比、外植体类型、苗龄、添加AgNO3等被认为是影响黄瓜离体体细胞再生的关键因素[1，2]。侯爱菊等[3]比较了品种、外植体类型、不同激素配比等因素对黄瓜离体体细胞再生的影响，发现三者对于芽再生频率均有显著影响，最高每外植体出芽数可为13.2个。

2 转化方法

早期的遗传转化是以发根农杆菌为工程菌介导的。Trulson等[4]采用发根农杆菌感染下胚轴，但由于毛状根再生的频率太低，只得到几株再生植株。随后施和平等[5]采用发根农杆菌研究了黄瓜子叶外植体毛状根再生的情况，除此之外，未见更多的使用发根农杆菌对黄瓜进行遗传转化的报道。

根癌农杆菌介导的遗传转化，因转化机理研究比较清楚，转化效率相对较高，目前为多数研究者所采用，是进行黄瓜转基因研究的主要方法。

许多研究者[6，9]对影响黄瓜遗传转化体系的因素进行了研究，如农杆菌菌株、质粒载体的类型、细菌侵染浓度、感染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度及使用方法、抗生素种类及浓度、筛选标记等，旨在建立成熟的转化体系，将目的基因有效导入黄瓜。但这些转化方法的外植体材料需要经过严格的培养与再生过程才能获得转基因植株，步骤繁琐，周期长。因此，研究者也一直在探索避开组织培养的简单、有效的转化途径，如：电击法、基因枪法、Floral dip方法、花粉管通道法等，。但这些方法虽操作简单，转化率却相对较低，转化机理尚不清楚。

3 目的基因

主要针对与黄瓜抗病（真菌病害、病毒病）、抗虫、抗逆、品质、产量等相关性状基因进行转基因研究。

3.1 抗病毒基因

病毒病是黄瓜主要病害之一。转入病毒外壳蛋白编码基因是抗病毒转基因黄瓜研究中应用较早和技术较为成熟的方法。利用病毒外壳蛋白编码基因转入植物，可以使病毒外壳蛋白在植物细胞中积累，能够抑制侵染病毒的复制，从而减轻症状或推迟病毒发生的时间。 Chee等[12]、Nishibayashi等[13]将黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因（CMV-CP）转入黄瓜，转基因植株抗性增强；王慧中等[14]将西瓜花叶病毒外壳蛋白基因（WMV-2CP）转入黄瓜，转基因植株可延迟发病时间，减轻发病程度。Gal-On等[15]将putative 54-kDa replicase gene转入黄瓜，转基因植株接 种 CFMMV （Cucumber fruit mottle mosaic tobamovirus）病毒，植株抗性达免疫程度，而且抗根部侵染。

3.2 几丁质酶基因

黄瓜在保护地栽培中极易受到真菌病害侵袭，严重影响黄瓜产量和品质，如白粉病、枯萎病、灰霉病等。植物几丁质酶因能水解真菌细胞壁的主要成分几丁质，在抗植物真菌病害反应中发挥了重要的作用。来自日本的研究小组多年来深入研究了几丁质酶基因对提高黄瓜抗真菌病害的作用：Kishimoto等[16～17]将来源于水稻的 class I几丁质酶基因转入黄瓜，发现转基因植株叶表皮及叶肉内几丁质酶基因表达量上升，田间试验表明，植株抗灰霉病，抗疫霉病菌，但不抗枯萎病；Kishimoto等[18]又进行class III几丁质酶基因转化黄瓜研究，接种灰霉病病菌后发现，感染后4 d内抗性明显高于对照，但随后发病。

3.3 甜蛋白基因

植物甜蛋白是从植物中发现的一类具有甜味的蛋白质。植物甜蛋白具有许多优点：甜度高，低热量，无毒安全。甜蛋白（Thaumatin）提取自热带植物T.daniellii中，产量低，不能满足市场需要，于是研究者开展了Thaumatin的基因工程研究，Thaumatin基因已被用来转化了数种微生物、真菌和高等植物。

波兰研究小组多年来一直进行黄瓜Thaumatin基因转化研究，用于黄瓜果实品质改良：Malepszy等[19]将preprothaumatin II基因转入黄瓜，发现preprothaumatin II在叶片、茎和果实中均有表达，果实有甜味，同时发现植株对霜霉病有抗性；Kiekiewicz等[20]田间调查发现，转甜蛋白基因植株对蚜虫、螨类、蓟马的吸引力明显降低；Szwacka等[21]用35S启动子，将甜蛋白基因转入黄瓜，并研究了甜蛋白在不同器官、不同时期的表达差异。

3.4 单性结实相关基因

提高栽培品种的单性结实能力，对于设施栽培条件下黄瓜正常结实，保证产量及商品性具有重要意义。由于果实发育与IAA直接相关，增加花芽中IAA水平，可促进单性结实果实的发育和增加果实的产量。色氨酸单加氧酶（IAAM）是IAA生物合成中吲哚乙酰胺途径的关键酶，其编码基因iaaM已被克隆，利用iaaM转化植株，已成功改良许多农作物品种。目前应用最多效果最好的是DefH9-iaaM嵌合基因，其中的iaaM基因编码区分离自萨氏假单孢菌，它还包含了在子房中特异表达的DefH9启动子。Yin等[22]将DefH9-iaaM基因转入黄瓜，转基因株系中70%～90%可单性结实，且所结籽粒较小。苏绍坤等[9]转化iaaM基因，果实经检测80%为单性结实。生长素结合蛋白（ABP1）为生长素受体，将编码该蛋白的基因转入植物体，植物体内生长素结合蛋白含量提高，能促使植株对生长素的敏感性增强。白吉刚等[23]转化生长素结合蛋白基因（ABP1）发现，转基因植株果实单性结实能力明显提高。

3.5 抗寒相关基因

研究发现植物中存在许多不同的转录调控途径，能够使一些基因的表达被逆境胁迫诱导，从而对胁迫作出响应，其中转录因子是参与转录调控途径的蛋白质。DREB类转录因子是AP2/EREBP转录因子家族的一个亚家族，能够特异性地与抗逆基因启动子区域的DRE顺式作用元件相结合，在低温、干早和盐碱等条件下调节一系列下游逆境应答基因的表达，是逆境适应中的关键性调节因子。其中DREB1/CBF类成员已在拟南芥、小麦、烟草、油菜等作物中鉴定主要参与低温胁迫应答反应。邓小燕等[24]将转录因子CBF3转入黄瓜，获得了转基因植株。纪巍等[25]将受干旱、高盐、低温等胁迫信号诱导的rd29A启动子和组成性表达的35S启动子驱动的DREB1A基因转入黄瓜中，分别获得PCR检测阳性株，而且观察到rd29A启动子驱动得到的植株性状表现更好。

3.6 花器官发育相关基因

黄瓜雌花节位的高低是影响产量的主要因素，选育强雌或全雌性品种是目前黄瓜育种的主要目标之一，同时研究黄瓜花发育的分子机制具有重要的理论意义。乙烯可强化高等植物的雌性表达，ACC合酶（ACS）是乙烯生物合成过程中的关键酶，研究表明ACS基因可能与F基因（控制雌性表达）有关。李泠等[26]将从黄瓜中克隆到的ACC合酶（ACS1）基因转入黄瓜，获得转基因植株，发现转基因植株的性型表现较复杂。MADS-box是调控黄瓜性别发育的另一类基因家族，已经从黄瓜中分离得到很多MADS-box基因，它们与器官的成熟早晚、产量及品质密切相关。赖来等[27]报道了将从黄瓜中克隆到的MADS-box同源基因CSMADS06，转化到不同品系的黄瓜S06和S52中，可获得抗性植株。

3.7 抗除草剂基因

抗除草剂基因在植物遗传转化中多用作选择标记，同时又可用来做转化的目的基因。金红等[28]将除草剂bar基因转入黄瓜，同时利用转基因纯合株系为父本与非转基因母本杂交，对其后代进行杂交种纯度鉴定，对转基因植株及杂交组合后代进行除草剂喷雾，结果表明转基因植株84%表现较高抗性，杂种纯度鉴定准确率达100%。

3.8 抗虫基因

黄瓜栽培中因蚜虫、茶黄螨、白粉虱等的为害，时常造成减产等重大损失，而且因害虫防治还会引发农药残留、环境污染等一系列问题，选育抗虫黄瓜新品种是持续控制害虫的根本措施。张文珠等[29]将复合结构域蛋白酶抑制剂基因，转入黄瓜，获得了转基因植株。

3.9 功能食品相关基因

促胰岛素基因：王翠艳等[30]将GAD-GLP-1和多拷贝长效GLP-1基因，成功转入黄瓜，并完成分子及药效检测，有望进一步结合常规育种培育食用功能型黄瓜预防和治疗糖尿病。抗衰老基因：Lee等[31]转化木薯的超氧化物歧化酶基因（Superoxidedismutase，SOD），期望利用黄瓜作为生物反应器，产生抗衰老的SOD，SOD活性检测表明从转基因植株上收获的黄瓜果实中的SOD活性是未转基因黄瓜的3倍。

4 黄瓜转基因植株安全性评价

转基因食品的安全性一直为社会所关注，主要包括食用安全与环境安全。黄瓜作为加工与鲜食为主的蔬菜，转基因植株及果实的安全性更为研究者所重视。研究者Koga-Ban等[32]将几丁质酶基因转入黄瓜，获得抗灰霉病转基因黄瓜，分别从以下几方面进行安全性研究：①植株和果实的形态学特点；②育性；③对环境产生可能的为害性；④土壤微生物群落的影响；⑤农杆菌残留。结果表明除了几丁质酶基因表达和灰霉病抗性表达外，发现与非转基因植株无差异。

5 问题与对策

研究者对黄瓜转基因研究进行了多年坚持不懈的努力，取得了很多进展。但依然存在以下问题。

①黄瓜农杆菌介导的遗传转化效率较低，如要获得育种应用的优良株系，需要进行大量外植体的转化工作，工作量较大。因此仍需进一步完善提高黄瓜农杆菌介导的遗传转化体系，同时探索适宜黄瓜遗传转化应用的新方法。

②目的基因分散，对比上述有关国内、国际黄瓜转基因研究内容可见，波兰和日本研究团队多年来围绕几丁质酶基因和甜蛋白基因开展了持续有效的工作，而国内则从多方面进行了探索性研究，围绕一个目标进行持续研究的少。因此在今后的研究中应找准切入点，进行深入而持续的研究。

③筛选标记问题，几乎所有的植物遗传转化中都要使用选择性标记基因，如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子，由此而引起公众的安全性顾虑以及环境释放的安全性问题也要考虑。因此，研究者已陆续在开展一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因植物，这种新策略（无标记）有着巨大的应用潜力。

伴随转基因技术的不断发展和成熟，相信转基因植株的安全性问题将会得到良好的解决，另外，消费者、生产者及管理机构将更能接受转基因食品，转基因技术将在黄瓜育种中发挥更重要的作用。

[1]Rajagopalan P A,Perl-Treves R.Improved cucumber transformation by a modified explant dissection and selection protocol[J].Hort Science,2005,40(2):431-435.

[2]赵隽，王华，潘俊松，等.黄瓜子叶节离体再生体系的研究[J].上海交通大学学报：农业科学版，2004，22（1）：43-47，53.

[3]侯爱菊，朱延明，杨爱馥，等.诱导黄瓜直接器官发生主要影响因素的研究[J].园艺学报，2003，30（1）：101-103.

[4]Trulson A J,Simpson R B,Shahin E A.Transformation of cucumber(Cucum issativusL.)plants with Agrobacterium rhizo genes[J].Theo Appl Genet,1986,73:11-15.

[5]施和平，李玲，潘瑞炽.乙酰丁香酮对发根农杆菌遗传转化黄瓜的影响[J].云南植物研究，1997，19（4）：445-448.

[6]Chee P P.Transformation of Cucumis sativus tissue by A-grobacterium tumefaciens and the regeneration of transformed plants[J].Plant Cell Rep,1990,9:245-248.

[7]Sarmento G G,Sarmento G G,Alpert K,et al.Factors influencing Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and expression of kanamycin resistance in picking cucumber[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,1992,31:185-193.

[8]陈峥，金红，程奕，等.提高黄瓜农杆菌遗传转化体系再生频率的研究[J].天津农业科学，2001，7（4）：47-49.

[9]苏绍坤，刘宏宇，秦智伟.农杆菌介导iaaM基因黄瓜遗传转化体系的建立[J].东北农业大学学报，2006，37（3）： 289-293.

[10]董伟，陈玲，吴勇.黄瓜自花授粉后外源DNA导入技术研究[J].园艺学报，1993，20（2）：155-160.

[11]李远新，王关林，葛晓光.黄瓜授粉后外源基因直接导入技术研究[J].华北农学报，2000，15（2）：89-94.

[12]Chee P P,Slifhtom J L.Transformation and expression of cumbermosaic virus coat protein gene in the genome of Cucumis sativus[J].Hort Science，1991，116：1 098-1 102.

[13]Nishibayashi S,Hayakawa T,Nakajima T,et al.CMV protein in transgenic cucumber plants with an introduced CMV-cp gene[J].Theor Appl Genet,1996,93:672-678.

[14]王慧中，赵培洁，周晓云.转WMV-2CP基因黄瓜植株的再生[J].植物生理学报，2000，26（3）：267-272.

[15]Gal-On A,Wolf D,Antignus Y,et al.Transgenic cucumbers harboring the 54-kDa putative gene of Cucumber fruit mottle mosaic tobamovirus are highly resistant to viral infection and protect non-transgenic scions from soil infection[J].Transgenic Research,2005,14(1):81-93.

[16]Kishimoto K,Nishizawa Y，Tabei Y，et al.Detailed analysis of rice chitinase gene expression in transgenic cucumber plants showing different levels of disease resistance to gray mold (Botrytis cinerea)[J].Plant Science,2002,162(5):655-662.

[17]Kishimoto K,Nakajima M,Nishizawa Y,et al.Response of transgenic cucumber expressing a rice class I chitinase gene to two fungal pathogens with different infectivities[J].Journal of General Plant Pathology,2003,69(6)：358-363.

[18]Kishimoto K,Nishizawa Y,Tabei Y,et al.Transgenic cucumber expressing an endogenous class III chitinase gene has reduced symptoms from Botrytis cinerea[J].Journal of General Plant Pathology,2004,70(6):314-320.

[19]Malepszy S,Szwacka M.Evaluation of transgenic cucumbers expressing the thaumatin gene[J].Use of Agriculturally Important Genes in Biotechnology,2000:131-134.

[20]Kosieradzka I,Sawosz E,Winnicka A,et al.The effect of transgenic cucumbers expressing thaumatin on selected immunity parameters in rats[J].Journal of Animal and Feed Sciences,2004,13(2):97-100.

[21]Szwacka M,Siedlecka E,Zawirska-Wojtasiak R,et al.Expression pattern of the pre-prothaumatin II gene under the control of the CaMV 35S promoter in transgenic cucumber (Cucumis sativusL.)flower buds and fruits[J].Journal of Applied Genetics,2009,50:1,9-16.

[22]Yin Z M,Malinowski R,Ziokowska A,et al.The DefH9-iaaM containing construct efficiently induces parthenocarpy in cucumber[J].Cellular&Molecular Biology Letters,2006,11(2):279-290.

[23]白吉刚，王秀娟，刘佩瑛，等.生长素结合蛋白基因转化黄瓜的研究[J].中国农业科学，2004，37（2）：263-267.

[24]邓小燕，张兴国，井鑫，等.冷诱导转录因子基因CBF3转化黄瓜的研究[J].西南农业大学学报：自然科学版，2004，26（5）：603-605.

[25]纪巍，李杰，朱延明，等.不同启动子调控的DREB1 A基因对黄瓜的遗传转化[J].东北农业大学学报，2005，36（4）：442-447.

[26]李泠，潘俊松，何欢乐，等.黄瓜离体培养再生技术及农杆菌介导的ACS1转化[J].上海交通大学学报：农业科学版，2007，25（1）：17-23.

[27]赖来，潘俊松，何欢乐，等.农杆菌介导的MADS-box基因转化黄瓜初步研究[J].上海交通大学学报：农业科学版，2007，25（4）：374-382.

[28]金红，杜胜利，陈峥.抗除草剂转基因黄瓜的获得及T1植株的抗性鉴定[J].华北农学报，2003，18（1）：44-46.

[29]张文珠，魏爱民，杜胜利，等.黄瓜农杆菌介导法与花粉管通道法转基因技术[J].西北农业学报，2009，18（1）：217-220.

[30]王翠艳，丁东风，于小菊，等.用floral dip法对黄瓜遗传转化的初步研究[J].生物学通报，2008，43（2）：9-12.

[31]Lee H S.Transgenic cucumber fruits thatproduce elevated level of an anti-aging superoxide dismutase[J].Molecular-Breeding,2003,11(3):213-220.

[32]Koga-Ban Y，Tabei Y，Ishimoto M，et al.Biosafety assessment of transgenic plants in the greenhouse and the field-a case study of transgenic cucumber[J].Japan Agricultural Research Quarterly， 2004，3（38）:167-174.