益肾调督针法对急性脑缺血再灌注大鼠IL-10表达的影响*

庞 勇,陈丽容,冯 卓,畅英才,吴 刚

(广西中医学院第一附属医院,广西南宁 530023)

白细胞介素(IL)是主要由单核细胞产生的一组免疫活性因子,作用于白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和其他细胞,发生多种生物学效用,共同参与机体免疫反应、应激反应和炎症的调节[1]。近年来的基础和临床实验发现,在缺血再灌注过程中,IL的表达明显增加,作用于白细胞、血管内皮细胞、神经细胞等,参与缺血性脑损伤的病理生理过程。本实验以脑缺血再灌注大鼠脑组织和血清中白细胞介素 -10(IL-10)的含量变化为指标,研究针刺抗脑缺血后炎性损伤的机制,旨在证明增强 IL-10的表达来抑制炎性细胞的大量分泌,从而改善微循环,促进大脑血供,有利于大鼠脑神经功能的恢复。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年 SD大鼠,雄性,体重(260±30)g,普通级,共 110只,由广西中医学院实验动物中心提供。

1.2 动物模型制备 将大鼠以 3%戊巴比妥(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰卧固定于手术台上,取颈部正中切口,钝性分离甲状腺,将其上翻并加予保护,分离左侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)和颈内动脉(internal carotid artery,ICA),用丝线结扎 ECA和 CCA近心端,于ECA处置一动脉夹,参照改良 Zea bonga方法,于 CCA近分叉处剪一约 0.2 mm侧“V”形切口,插入栓线,插入深度约 18.5 mm,使栓线进入 ICA,越过大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)开口处,到达大脑前动脉(anterior cerebral artery,ACA)起始部,阻断大脑中动脉的所有血液来源,扎紧备线,甲状腺复位,关闭并缝合皮肤切口。术中室温保持在 25℃。术后用白炽灯照射,温度控制在 37℃给大鼠保温。

1.3 神经症状行为学检测 大鼠清醒后 1～2 h采用Longa等[2]的 5分制标准评分。0分：无神经缺损症状;1分：不能伸展对侧前爪;2分：行走时向偏瘫侧转圈;3分：向偏瘫侧倾倒;4分：不能自发行走,意识丧失。将造模成功(2～3分)的大鼠用于实验。

1.4 实验动物分组及治疗方法

1.4.1 实验分组 将大鼠随机分成 11组,每组 10只。正常组：不予任何处理;假手术组：将线插入后随即拔出;模型 12 h组：脑缺血 1 h/再灌注 12 h;模型 24 h组：脑缺血 1 h/再灌注 24 h;模型 48 h组：脑缺血 1 h/再灌注 48 h;普通针刺组 12 h组：脑缺血 1 h/再灌注 12 h同时进行普通针刺;普通针刺组 24 h组：脑缺血 1 h/再灌注 24 h同时进行普通针刺方法;普通针刺组 48 h组：脑缺血 1 h/再灌注 48 h同时进行普通针刺方法;益肾调督针法 12 h组：脑缺血 1 h/再灌注 12 h同时进行益肾调督针法;益肾调督针法 24 h组：脑缺血 1 h/再灌注 24 h同时进行益肾调督针法;益肾调督针法 48 h组：脑缺血1 h/再灌注 48 h同时进行益肾调督针法。

1.4.2 治疗方法 (1)正常组：不予任何处理。(2)假手术组：将线插入后随即拔出。(3)模型组：造成局灶性脑梗塞模型不做针刺治疗。(4)益肾调督针法组：针刺百会、风府、大椎、命门、肾俞、太溪。后两穴用患侧。方法：手捻针,百会、风府、大椎用平补平泻手法,命门、肾俞、太溪用捻转补法,留针 30 min,每 5 min行针 1次。(5)普通针刺组：针刺患侧合谷、曲池、足三里、昆仑。手捻针,平补平泻手法,留针 30 min,每 5 min行针 1次。12 h针刺组于手术后 1 h针刺,处死前蓄积 1次;24、48 h针刺组 1日针两次,处死前蓄积 1次。

1.5 标本收集 每只造模成功的大鼠在规定的时间点麻醉,开胸暴露心脏,自右心房取血 2 ml,4℃过夜,然后 2000 g/min离心 20 min,取上清封存,置于-20℃冰箱待测;同时,用 0.9%生理盐水及 4%多聚甲醛各 200 ml作心脏灌注固定,断头取脑,分开两侧大脑半球,在右侧距额极 2.5 mm处向后切取 2.5 mm脑组织,称重,按 0.1 g∶l ml的比例加 4%多聚甲醛作脑组织匀浆 2000 g/min离心 20 min,取上清封存,置于 -20℃冰箱待测。

1.6 白细胞介素 -10的测定 白细胞介素 -10的测定采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,EILSA),试剂盒的使用严格按照说明书进行。

1.7 统计学方法 采用专业统计软件包 SPSS13.0进行统计,所有数据均采用±s表示。各组差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),继以 LSD检验。

2 结果

2.1 MCAO大鼠血清中 IL-10含量的变化及针刺的影响 见表 1。

表1 各组大鼠血清中 IL-10含量 (±s,n=10)

表1 各组大鼠血清中 IL-10含量 (±s,n=10)

注：与正常组比较,*P＜0.05,**P＜0.01;与同时段模型组比较,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;与同时段益肾调督组比较,#P＜0.05,##P＜0.01。

组别 IL-10(μg/ml)正常组 20.78±2.11假手术组 20.92±2.13**12 h模型组 23.03±2.28**12 h益肾调督组 30.56±3.13**▲▲12 h普通针刺组 26.70±3.00**▲▲##24 h模型组 27.26±2.59**24 h益肾调督组 42.73±2.93**▲▲24 h普通针刺组 36.96±2.12**▲▲##48 h模型组 35.70±2.18**48 h益肾调督组 50.10±2.34**▲▲48 h普通针刺组 44.42±1.89**▲▲##

2.2 MCAO大鼠脑组织中 IL-10含量的变化及针刺的影响 见表 2。

从表 1、表 2可以看出,与正常组比较,模型组、益肾调督组、普通针刺组脑组织与血清中 IL-10含量显著上升,而假手术组比较差异无显著。与同时段模型组比较,益肾调督组、普通针刺组在各时相差异具有显著性。同时段普通针刺组与益肾调督组比较,差异具有显著性意义,说明两组针法均能提高大鼠缺血后 IL-10的含量,尤以益肾调督组增加显著。

表2 各组大鼠脑组织中IL-10含量 (±s,n=10)

表2 各组大鼠脑组织中IL-10含量 (±s,n=10)

注：与正常组比较,*P＜0.05,**P＜0.01;与同时段模型组比较,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;与同时段益肾调督组比较,#P＜0.05,##P＜0.01。

组别 IL-10(pg/ml)正常组 20.12±2.17假手术组 19.90±1.64**12 h模型组 24.97±1.42**12 h益肾调督组 33.64±2.35**▲▲12 h普通针刺组 30.16±2.61**▲▲##24 h模型组 34.69土 2.53**24 h益肾调督组 47.04±2.84**▲▲24 h普通针刺组 40.85±2.31**▲▲##48 h模型组 24.97±1.46**48 h益肾调督组 71.91±3.42**▲▲48 h普通针刺组 54.55±2.77**▲▲##

2.3 各组大鼠脑缺血后神经功能损伤评分比较 见表3。

从表 3可以看出,与正常组比较,模型组、益肾调督组、普通针刺组差异显著,而假手术组比较差异不显著;各时相上模型组动物神经功能缺损症状随时间延长逐渐减轻,但差异无统计学意义;益肾调督组与模型组在各时相上的 NSS比较,差异均具有显著性差异,而普通针刺组与模型组在各时相上的 NSS比较,以24 h、48 h差异有显著意义(P＜0.05)。益肾调督组与普通针刺组在各时相上的 NSS比较,以同时段 48h比较差异有显著意义(P＜0.05),说明益肾调督针法与普通针刺方法均能提高大鼠缺血后神经功能损伤的恢复,而益肾调督针法更有利于大鼠神经肢体功能的恢复。

表3 各组大鼠脑缺血后神经功能损伤评分比较 (±s)

表3 各组大鼠脑缺血后神经功能损伤评分比较 (±s)

注：与正常组比较,*P＜0.05,**P＜0.01;与同时段模型组比较,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;与同时段益肾调督组比较,#P＜0.05,##P＜0.01。

组别 例数 12 h 24 h 48 h正常组 10 0 - -假手术组 10 0 - -模型组 10各亚组 2.4±0.51** 2.4±0.51** 2.2±0.63**益肾调督组 10各亚组 1.9±0.56**▲ 1.5±0.52**▲▲ 1.3±0.48**▲▲普通针刺组 10各亚组 2.2±0.42** 1.9±0.31**▲ 1.8±0.42**▲#

3 讨论

本实验结果表明在急性脑缺血早期,IL-10的含量在 3个观察的时间点均高于正常水平,随着时间的延长 MCAO神经功能缺损症状随时间延长逐渐减轻,可推测,可能在急性脑缺血早期 IL-10发挥抑制促炎症细胞因子(IL-1β,TNF-a,IL-6)等的表达,从而抑制脑缺血后炎症反应以及免疫损伤,减少脑缺血后神经元的坏死,这与文献[3,4]报道相似。此外,施予针灸治疗后,MCAO大鼠血清及脑组织中的 IL-10含量较没有施予针灸治疗的 MCAO大鼠明显升高,且MCAO神经功能缺损症状减轻程度均较没有施予针灸治疗的 MCAO更明显。因此,可推测针灸在急性脑缺血早期可增高血清及脑组织中的 IL-10的含量,从而达到保护神经元、防治脑缺血损害的作用。

研究还表明,益肾调督针法与普通针刺法均能够不同程度的提高 MCAO血清及脑组织中 IL-10的含量,达到抑制炎性细胞在缺血区的聚集和激活,而抑制细胞毒性物质的释放,从而改善微循环,促进大脑血供,利于大鼠脑神经功能恢复的作用,而两种针法比较以益肾调督针法效果更为显著,是临床上值得进一步推广和运用的减少脑缺血损害的一种有效的针灸疗法。

此外笔者在研究中还发现,血清及脑组织 IL-10在急性脑缺血形成后含量呈动态变化。本实验测定了脑缺血后 12 h、24 h及 48 h血清及脑组织中 IL-10水平：缺血后 12 h IL-10表达较低,24 h及 48 h两个时间点表达显著增高,这与 Li HL[5]等测定持续 MCAO大鼠脑 IL-17、IFN-Y和 IL-10mRNA表达水平时发现缺血后 1-12 hIL-10mRNA表达较低,24 h～6天逐渐升高的报道相符。笔者认为,脑缺血 12 h内由于大量的炎性因子开始分泌,而 IL-10在 12 h内分泌较少而消耗较多,因此 12h IL-10表达较低;可能是受血循环中 TNF-α等炎性因子的持续刺激,IL-10在 24 h及 48 h表达显著增高,而进行针灸治疗后,IL-10在血清及脑组织中的表达更明显的增高,因此本实验也证明了脑缺血针灸介入治疗的越早越能减少脑缺血对神经元的损害。

由于人力、物力、时间等客观因素的影响,本实验的时段选择具有局限性,不能涵盖脑缺血发病的整个过程。 IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子在脑缺血的病因和发病机制中起重要作用,但其作用却并不是独立的,本实验研究的指标尚少,不能全面的揭示脑缺血整个发病过程中多种炎性因子的表达及之间的关系,因此益肾调督针法对脑缺血后各细胞因子之间的关系及各细胞因子对脑缺血损伤的保护机制有待进一步研究。

[1] 邢成名.缺血性脑血管病[M].北京：人民卫生出版社,2003：134

[2] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)：84-91

[3] 刘楠,陈荣华,郑安,等.IL-10对大鼠脑缺血保护作用的研究[J].中国药学杂志,2005,40(13)：988-990

[4] 袁红,宋颖,欧翔,等.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠 IL-6、IL-10表达影响的实验研究[J].北京中医药大学学报(中医临床版),2006,13(4)：18-21

[5] Li HL,Kostulas N,Huang YM,et al.IL-17 and IFN-gamma mRNA expression is increased in the brain and systemically after permanent middle cerebral artery occlusion in therat[J].Neuroimmunol,2001,116(1)：5