无偿献血人群HCV感染的检测和输血残余风险分析

欧阳玲，黄建国，谢秀华，黄守民

(广东省深圳市宝安区中心血站，广东 深圳 518101)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)引起的在全世界流行的传染病。椐WHO报道，全球约有1.7亿感染者(流行率约3%)，我国感染者约为4100万。HCV传播主要是通过污染的血液和血制品，传播途径主要有输血、静脉注射毒品、性传播、不洁医疗仪器应用、纹身和母婴传播等[1]。我国国家标准规定采供血机构对献血者血液必须采用EIA法进行抗-HCV抗体的检测，通过检测抗-HCV可大大降低输血后感染HCV的风险，但是由于检测抗-HCV的窗口期较长，目前仍存在一定潜在的输血后传播HCV的风险。为了进一步减少输血传播的HCV的风险，保证临床输血安全，为了解本地区献血者人群HCV感染情况，以及经病毒血清学筛查后的输血感染HCV残余风险，我们引进罗氏诊断公司NAT检测试剂COBASAmpliScreens对血液进行HCV RNA检测[2]，现将研究结果报告如下。

材料与方法

1检测对象和标本采集

1997年1 月至2009年6月在深圳市宝安区中心血站献血的所有志愿无偿献血者，采集血液样本共254570人份，其中男性151 760人，女性102 810人，年龄范围18～55岁，平均26岁。NAT检测用样本采用无菌抗凝管(美国BD公司)留取全血5m l，于6h之内离心分离出血浆，并冻存在-20℃冰箱。

2主要试剂和仪器

抗-HCV检测EIA试剂分别来自厦门新创、华美生物、美国雅培和Ortho公司，试剂盒均有中国生物制品研究所批批检及防伪标签。HCV RNA NAT检测试剂COBASAmpliscreen HCV Test Ver 2.0试剂盒和病毒核酸的提取试剂Multiprep Specimen Preparation Reagents Kits为瑞士罗氏诊断公司产品。

3无偿献血者血液的病毒血清学检测

所有献血者血液标本按照国家《献血者健康检查要求》(GB 184672 2001)进行常规的抗-HIV-1/2、抗-HCV、HBsAg、抗-TP和ALT项目的初检和复检。其中抗-HCV EIA筛查试剂初检为国产试剂厦门新创或华美生物,复检为进口美国雅培或Ortho公司试剂,采用美国奥斯邦AT全自动样本加样系统加样和费米全自动酶免分析系统进行自动检测，任何一种试剂检测呈阳性反应报告为抗-HCV阳性。

4无偿献血者血浆标本中HCV RNA的NAT检测

采用混合样本NAT(MP-NAT)方法检测EIA-阴性的献血者血液标本[4]。将EIA检测HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2阴性和ALT正常的血浆标本，按48份×50μl汇集于 2个离心管中 (1份备用)，23 600g，4℃离心 1h，吸去上清，留 200μl血浆，用 Multiprep Specimen Preparation Reagents Kits提取病毒核酸，具体按说明书操作。用COBASAmpliScreens HCV Test(Ver 2.0)试剂检测HCV RNA,由配套Ampilcor分析仪自动完成RT-PCR扩增、变性、探针杂交、显色、检测和结果判断。MP-NAT检测呈阳性反应时，将其2个24份混合标本分别检测，24份混合标本检测呈阳性反应时，将这24份标本按6×4排列交叉混合汇集成10组再进行检测，根据交叉组合判断具体的阳性反应标本，最后再对阳性反应标本进行单人份NAT(ID-NAT)检测。EIA检测抗-HCV呈不确定反应的血液标本进行单人份NAT检测。

5 HCV的定量检测和基因亚型测定

[3]合成引物，用逆转录-套式聚合酶链反应(RT PC)扩增HCVE1和 NS5B基因，扩增阳性的PCR产物用双脱氧链终止法进行双向核苷酸序列测定，对所测定的基因进行基因分型。同时采用TagMan荧光定量PCR检测HCV RNA水平。

结 果

1 EIA检测献血者中抗-HCV的结果

用EIA法共筛查1997年1月～2009年7月所有的无偿献血者，每年筛查出抗-HCV阳性0.36～1.20%之间。13年来共筛查254 570人份的献血者血液标本，筛查出抗-HCV呈现阳性反应1 401人份，总的阳性率为0.55%(表1)；在不同性别的献血者中的抗-HCV检测结果见表2。

表1 深圳无偿献血人群中HCV感染者EIA和NAT检测结果

表2 不同性别献血者中抗-HCV阳性检出率

2合格献血者中HCV RNA的检测结果

对 2002～2007年期间 EIA检测 “合格”的113639份献血者血液标本进行NAT检测，结果检测出1份HCV RNA阳性、抗-HCV阴性的献血者血液，HCV残余风险高达1/113 639。该例献血者的标本的检测结果见表3。此外，对EIA检测抗-HCV不确定的163份献血者标本进行单人份NAT(IDNAT)检测,未检测出1例HCV RNA呈阳性反应的标本。

3 HCV RNA阳性献血者病毒载量和基因分型检测

表3 EIA抗-HCV阴性、NATHCV RNA阳性献血者标本的检测情况

从抗-HCV阴性的献血者中分离出的HCV分离株，序列分析为1b基因型。病毒定量为2.6e+5 copies/ml(表 3)。

讨 论

在1998年《中华人民共和国献血法》颁布实施前，我国职业献血者和HCV感染率一直处于一个较高的水平，文献报道为3.2～56.7%，输血传播肝炎主要以HCV感染为主[4]。《献血法》实施后,我国逐步实施无偿献血制度，临床血液采自公民的无偿自愿献血。无偿献血者中HCV感染率明显低于既往的职业献血者，从1997～2000年间的4.6%下降至2004～2007年的0.335%[5]。从我站的数据看，在2001年之前，抗-HCV阳性率位于0.63～1.2%之间，2002年～2009年抗-HCV阳性率位于0.34～0.58%之间，呈现下降趋势。无偿献血者中抗-HCV阳性率的下降，使输血的安全性得到了提高。

虽然应用第三代EIA试剂对献血者进行抗-HCV的筛查后，输血传播HCV得到明显的控制，但输血感染HCV的风险仍然存在。文献报道我国目前输血传播HCV的风险约为1/60000～1/40000[6]。研究显示使用3代EIA试剂盒进行血液HCV筛查后的窗口期为70～83d，而核酸扩增技术(NAT)由于直接检测病毒核酸,可使HCV检测的窗口期缩短至22d，能够降低输血传播HCV的残余危险度50%以上。目前,已有20多个国家和地区将NAT检测作为献血者的常规血液筛查项目。在欧美等一些HCV感染率较低的国家,NAT检出率在1/23.4～1/205万之间[7]；在HCV感染较高的一些东南亚国家,NAT检出率在 1/5.2～1/14.3 万之间[8]。本地区 2001～2004年的无偿献血者资料回顾总结，经数学模型分析推测的HCV残余风险为1/59588[6]，本研究在113639份血清学检测合格的献血者标本中发现1份HCV窗口期感染的血液，检出率为1/113639，与东南亚国家的检测情况相接近。本地区输血传播HCV风险比较高，控制输血传播HCV任重道远。NAT检测由于成本等因素尚未列入国家对血液的强制检测项目，但考虑本地区献血者的特点和HCV流行情况，增加MP-NAT筛查血液对减少输血传播病毒感染的风险意义重大。

参考文献

[1]Verbeeck J,Maes P,Lemey P,et al.Investigating the origin and spread of hepatitis C virus genotype 5a[J].JVirol,2006,80(9):4220-4226.

[2]黄呈辉,黄建国,欧阳玲,等.应用核酸扩增技术对血液中HBV、HCV和HIV-1检测[J].中国输血杂志,2005,18(3):202-204.

[3]Lu L,Nakano T,He Y,et al.Hepatitis C virus genotype distribution in China:predominance of closely related subtype 1b isolates and existence of new genotype 6 variants[J].Journal of Medical Virology,2005,75(4):538-549.

[4]The Global Burden Of hepatitis CWorking Group.Global burden of disease(GBD)for hepatitis C[J].JClin Pharmacol,2004,44(1):20-29.

[5]戎 霞,夏文杰,王 敏,等.广州地区首次参加无偿献血人群HCV感染的流行病学调查[J].中国输血杂志,2009,22(11):883-885.

[6]Shang GF,Seed CR,Wang F,et al.Residual risk of transfusiontransmitted viral infections in shenzhen,china,2001 through 2004[J].Transfusion,2007,47:529-539.

[7]Stramer SL,Glynn SA,Kleinman SH,et al.Detection of HIV-1 and HCV infections among antibody negative blood donors by nucleic acids amplification testing[J].N Engl JMed,2004,351(8):760-768.

[8]Wong L,Lam S,Teo D.Overview of nucleic acid testing(NAT)on blood donations in Singapore[J].Vox Sang,2005,89(Suppl 2):19.