RP-HPLC法测定人血浆中米氮平的浓度Δ

黄洪勇，王金宝，李恒芬，钱东丽#，师天元，郭新胜（.新乡医学院第二附属医院，新乡市45300；.河南省生物精神病学重点实验室，新乡市 45300）

现代医学认为抑郁症的发病与遗传因素、神经递质、躯体、心理和性别等因素有关[1，2]。米氮平（Mirtazapine，MTZ）为全球首个去甲肾上腺素能和特异性5-羟色胺能抑制剂，具有独特的双重抗抑郁药理学特性，有起效快、疗效确切、耐受性好、无抗胆碱能作用等优点，目前己广泛应用于临床[3，4]。国外曾以监测患者体内米氮平的血药浓度来指导临床用药、预警不良反应和规避风险[5]。本试验建立了反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定人血浆中米氮平的浓度，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

1100型高效液相色谱仪系统，包括G1311A自动调配泵、G1316A可调柱温恒温箱、G1322A在线脱气、色谱化学工作站（美国Agilent公司）；XT-120A电子分析天平（瑞士Precisa公司）；LXJ-Ⅱ离心沉淀机（上海医分仪器制造有限公司）。

1.2 试药

米氮平对照品（无锡华裕生物制药有限公司，批号:080428，含量:99.6%）；内标:氯氮平对照品（美国Sigma公司，批号:010K1204）；甲醇为色谱纯，正丁胺、乙酸乙酯、乙醚为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:美国Diamonsil®（250 mm×4.6 mm，5 μm）C18反相柱；柱温:25 ℃；流动相:甲醇-0.3%正丁胺溶液（80∶20）；流速:1.0 mL·min－1；检测波长:292 nm；进样量:20 μL。 在该色谱条件下，色谱峰与血浆中内源性杂质峰很好分离，无干扰峰出现，米氮平和内标保留时间分别为6.59、8.07 min，主峰米氮平的有效塔板数应在9 500以上，分离度7.3，拖尾因子1.04。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制备

取米氮平对照品约10 mg，准确称定，加甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，即得。于冰箱4℃保存备用，临用前用甲醇稀释成所需浓度。另同法制备出浓度为10 μg·mL－1氯氮平的甲醇溶液为内标溶液。

2.3 血浆样品处理

取400 μL含药血浆加至10 mL具塞锥形玻璃离心管中，加入内标溶液100 μL，涡旋振荡1 min，加入提取剂乙酸乙酯-乙醚（1∶1）1 mL，涡旋振荡提取2 min，4 000 r·min－1离心10 min，取上层提取液置于一干燥具塞尖底试管中，再加入1 mL上述提取剂，同法操作。振荡混合2次提取液，40℃水浴氮气吹干，残渣用100 μL流动相复溶后，4 000 r·min－1离心10 min，取上清液20 μL进样。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察:取空白血浆300 μL共8份，分别加入不同浓度的米氮平对照品溶液100 μL，使血浆中药物浓度分别为0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg·mL－1，振荡混匀，然后按“2.3”项下方法处理，进样测定并记录色谱。以米氮平血药浓度（X）对米氮平峰面积与内标峰面积的比值（Y）进行线性回归，得标准曲线方程为Y＝0.267X+0.031（r＝0.999 9，n＝8），结果表明，米氮平血药浓度在0.1～20.0 μg·mL－1范围内线性关系良好。当信噪比（S/N）＝3时，最低检测限为0.05 μg·mL－1。

2.4.2 方法回收率及精密度试验:取空白血浆3份，分别制备成浓度各为1.0、4.0、16.0 μg·mL－1的米氮平血浆对照品溶液，然后按“2.3”项下方法处理。每种浓度日内平行测定5次，3种浓度隔日测定1次，各5次。分别计算日内、日间精密度，并根据同一天内低、中、高3种浓度血浆对照品测定结果计算相对回收率；另制备浓度各为1.0、4.0、16.0 μg·mL－1对照品溶液并分别进样5次，以此为标准，计算米氮平的绝对回收率，结果见表1。

表1 回收率及精密度试验结果（n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision test（n＝5）

2.4.3 稳定性试验:各制备低、中、高（1.0、4.0、16.0 μg·mL－1）3种浓度的米氮平血浆样品，于－20℃冰箱保存，分别在0、5、10、15、20 d时取出于37.5℃水浴融化后，按“2.3”项下方法处理，测定浓度。结果浓度变化的RSD＝4.85%，表明米氮平在血浆中至少放置20 d稳定。

2.4.4 患者血样含量测定:取患者上肢静脉血5 mL，取出血浆，平行处理3份（编号:MTZ-1、MTZ-2、MTZ-3），避光低温保存至测定。患者的血样测定结果见表2。

表2 患者的血样测定结果（n＝3）Tab 2 Results of the determination of plasma sample of patients（n＝3）

由表2可以看出，RP-HPLC法测定血浆中米氮平的浓度，重复性比较好，RSD值均＜2%。

3 讨论

笔者曾结合文献[6，7]，系统比较了乙醚与乙酸乙酯的提取效率，发现二者相差不大，但乙酸乙酯作为提取剂非常不易挥散，氮气吹干较难。本试验选用了复合提取剂，既保持了较高的提取效率，又减少了工作量。

抑郁症患者在药物治疗上大多联用了一些情绪稳定剂（如卡马西平）、镇静剂（如地西泮），因此，这些物质不易作为内标的首选。本试验选用了抑郁症患者不常联用的氯氮平作为内标，避免了患者血样本身对分析过程的影响，扩大了方法现实应用中的范围。

在有关米氮平含量的体内分析方法中，荧光检测法和毛细管电泳法样品前处理复杂[8，9]、液相色谱-单四极杆质谱法仪器昂贵[10]、其他高效液相色谱法则分析时间过长[6]，均远不能适应人体内米氮平的快速、准确分析。本试验采用的RP-HPLC法具有样品前处理简单、分析仪器普及率高、简便、快速、准确、灵敏等优点，适用于米氮平的临床药动学研究和不良反应监测。

（致谢:本研究在河南省生物精神病学重点实验室（新乡医学院）完成）

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