响应面法优化鲐鱼头酶解条件

傅春燕，周丹珺，陆 焰，刘冰冰，杨文鸽*

(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

响应面法优化鲐鱼头酶解条件

傅春燕，周丹珺，陆 焰，刘冰冰，杨文鸽*

(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

以鲐鱼头为原料，水解度为指标，采用单因素试验，比较中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对鲐鱼头的酶解效果，并进一步对风味蛋白酶的酶解工艺参数进行响应面法优化。结果表明：风味蛋白酶的酶解效果最好，其加酶量、酶解温度和时间对水解度均有极显著影响(P＜0.01)；响应面法优化得到鲐鱼头酶解的最适条件为风味蛋白酶添加量1311U/g、酶解温度46℃、反应时间7h，鲐鱼头的水解度达到31.18%。

响应面；鲐鱼头；酶解；水解度

鲐鱼(Pneumatophorus japonicns)，又名青鲇鱼，是海洋中上层低值鱼类，在我国各海域均有分布，尤以东海产量最多。鲐鱼也是我国重要的加工鱼种，每年加工成各类冷冻鱼片和鱼罐头数量达万吨[1]，而加工产生的鱼头、鱼骨和内脏往往成了水产品下脚料。这些下脚料一般加工成鱼粉或直接作为废物处理，高值化利用程度较低，因此开发利用鲐鱼加工下脚料具有重要意义。

研究表明：肠道能有效吸收蛋白水解物，尤以三肽吸收为最好[2]。另外，低分子肽不仅是重要氮源[3]，还具有众多生理功能，如降血压[4]、抗氧化[5]、提高免疫力[6]、防腐和抑菌等作用[7]。因此，酶解鱼品下脚料以获得较高价值的多肽类物质已成为目前的研究热点。Guerard等[8]利用中性蛋白酶酶解鲔鱼下脚料，以制备鱼蛋白粉；Bougatef等[9]酶解沙丁鱼头与内脏，以提取活性多肽。本实验利用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶以及风味蛋白酶对鲐鱼头进行酶解，筛选到合适的酶种类，并对酶解工艺进行优化，以获得易消化吸收的酶解液，为进一步开发利用鲐鱼头资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鲐鱼(P. japonicns)采自3～4月，每尾质量(200 ±20)g，购于宁波水产大世界，取鲐鱼头，经高速组织捣碎机捣碎均匀，冻藏备用；木瓜蛋白酶(11.8万U/g)广西南宁庞博生物工程有限公司；中性蛋白酶(19.1万U/g)、风味蛋白酶(2.2万U/g) 无锡市雪梅酶制剂科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BP221S型电子分析天平、Docu pH计 德国Sartorius公司；Biofuge Stratos高速冷冻离心机 德国Thermo

Fisher Scientific公司；XHF-1型内切式匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司；JB-3型定时恒温磁力搅拌器上海雷磁仪器厂；DS-1型高速组织捣碎机 上海标本模型厂。

1.3 方法

1.3.1 一般营养成分的测定

水分：105℃烘干法；总蛋白量[10]：半微量凯式定氮法；脂肪含量[11]：氯仿-甲醇法；灰分：550℃灼烧法。

1.3.2 鲐鱼头酶解液的制备流程

鲐鱼头→捣碎均匀→加入一定比例的水搅拌均匀→酶解→灭酶(沸水浴10min)→冷却→离心→取上清液→水解度测定

1.3.3 水解度的测定

以甲醛电位滴定法测定氨基酸态氮；水解度(DH)计算公式如下：

DH/%=(酶解液中的氨态氮总量－原料中本身含有的氨态氮总量)/原料中总氮含量×100

1.3.4 蛋白酶活力的测定

Folin-酚法[12]测定蛋白酶活力。

1.3.5 数据分析

采用SAS 9.1.3软件，进行响应面试验设计及数据分析。实验设置3～5个平行样。

2 结果与分析

2.1 鲐鱼头原料的一般营养成分

表1 鲐鱼头的一般营养成分Table1 The basic nutritional components of P. japonicns heads

由表1可以看出，鲐鱼头水分含量为64.36%，相对较高，不易保藏；其粗蛋白质含量达13.63%，是一种很好的蛋白质资源，值得开发利用。

2.2 鲐鱼头酶解工艺的单因素试验

2.2.1 加酶量的确定

取鲐鱼头原料，添加2倍质量的水，50℃保温5min后，分别加入0.6×103、0.8×103、1.0×103、1.2 ×103、1.4×103、1.6×103、1.8×103、2.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，50℃酶解7h，立即终止酶反应。取样测定其水解度，结果见图1。

图1 加酶量对鲐鱼头水解度的影响Fig.1 Effect of enzyme dosage on the DH of P. japonicns heads

由图1可知，当加酶量从0.6×103U/g递增到1.0× 103U/g，3种酶的水解效果均不断增加，但超过1.0× 103U/g后，水解度增加不明显。中性蛋白酶添加量1.0× 103U/g时，水解度达到最大13.03%，随后甚至有所下降；木瓜蛋白酶的水解度随着酶添加量的增加不断增加，但增加量不大；3种酶中风味蛋白酶的水解效果最好，添加量达1.2×103U/g时水解度最大。这与洪鹏志等[13]对研究黄鳍金枪鱼头酶解条件得到的结论相似，中性蛋白酶、风味酶在酶添加量超过1.4×103U/g原料后，木瓜蛋白酶在酶添加量超过1.1×103U/g原料后，水解效果已趋于平缓。原因在于随着酶量的增加，酶已逐渐被底物所饱和，酶促反应速度趋向最大值。

2.2.2 酶解温度的确定

取鲐鱼头原料，添加2倍质量的水，分别在40、45、50、55、60℃保温5min后，加入1.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或风味蛋白酶，在各温度条件下酶解7h。取样测定其水解度，结果见图2。

图2 温度对鲐鱼头水解度的影响Fig.2 Effect of temperature on the DH of P. japonicns heads

从图2可以看出，由40℃升至50℃，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果不断增强，但超过50℃后，水解度下降；风味蛋白酶在45℃时水解度达到最高，45℃到50℃水解度有所下降但幅度不大，55℃后水解度大幅度下降。温度的提高在一定程度上能提高一般化学反应的速率，但酶是一种活性蛋白，超过一定温度后会使

其失去部分催化活性，从而降低酶促反应速率。由图可知，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶的最适温度分别是50、50、45℃。

2.2.3 酶解时间的确定

取鲐鱼头原料，添加2倍质量的水，50℃保温5min后，分别加入1.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，5 0℃酶解1、2、3、4、5、6、7h，立即终止酶反应。取样测定其水解度，结果见图3。

图3 酶解时间对鲐鱼头水解度的影响Fig.3 Effect of time on the DH of P. japonicns heads

由图3可知，随着时间的延长，3种酶的水解度均有不断提高，特别是在最初的1h，增加速度最明显。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在1h后的水解度增加幅度远小于风味蛋白蛋白酶，风味蛋白酶在5h之前的水解度都在迅速增加，随后趋于平缓。洪鹏志等[13]研究表明时间对木瓜蛋白酶的酶解效果影响不大，在4h之内中性蛋白酶和风味蛋白酶的水解效果均随着时间的增加而增强；侯温甫等[14]研究得到淡水鱼头酶解时的最佳酶解时间为5h，本实验结果与之相近。

2.2.4 料液比的确定

取鲐鱼头原料，按原料质量的1、2、3、4、5、6倍添加水，使料液比分别达到1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6(g/mL)，50℃保温5min后，分别加入1.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，50℃酶解7h，立即终止酶反应。取样测定其水解度，结果见图4。

图4 料液比对鲐鱼头水解度的影响Fig.4 Effect of water dosage on the DH of P. japonicns heads

由图4可知，中性蛋白酶与风味蛋白酶在1:1(g/mL)时水解度较低，1:2(g/mL)时达到最大，1:2～1:6(g/mL)变化时，中性蛋白酶的水解效果有所下降，风味蛋白酶的水解效果有上下波动，但变化不大；而木瓜蛋白酶的水解效果在料液比1:1、1:2(g/mL)时最大，而后有所降低，与相关研究报道结果相符。周涛等[15]在研究鲐鱼废弃物酶解条件时得到的最佳料液比为5:8(g/mL)；段振华等[16]在研究鳙鱼下脚料的酶解时也发现当料液比从1:1(g/mL)减小到1:2(g/mL)时，水解效果上升最快，而后变缓。因为当反应体系中水分增加时，降低了反应产物的浓度，减轻了产物对酶促反应的反馈抑制作用；而水分进一步增加降低酶浓度，导致了水解效果的下降。

由单因素试验可以看出，风味蛋白酶在3种酶中的酶解效果最好，最佳反应条件约为酶添加量1.2×103U/g原料、反应温度45℃、反应时间6h、料液比为1:2 (g/mL)，水解度可达30%以上，而中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的水解度均在15%以下。因此选取风味蛋白酶，并进一步对酶解工艺进行响应面优化。

2.3 风味酶酶解鲐鱼头的响应面优化

2.3.1 响应面优化试验因素水平的选取

参考单因素试验结果，采用响应面方法在三因素三水平上对酶添加量、酶解温度、酶解时间进行优化。根据中心组合试验设计原理，试验因素与水平设计见表2。

表2 响应面优化因素与水平Table2 Factors and levels of the experiment

2.3.2 响应面优化试验设计及结果

表3 响应面优化试验方案及结果Table3 Experimental design and results of the experiment

响应面优化试验设计及结果见表3，方差分析和酶解各因素的显著性比较结果见表3、4。

表4 水解度回归模型方差分析表Table4 Variance analysis of regression equation

利用SAS软件对所得数据进行回归分析，对各因素回归拟合后，得到回归方程为：

图5 酶添加量与温度对鲐鱼头水解度的影响Fig.5 Response surface showing the effect of enzyme dosage and temperature on the DH of P. japonicns heads

图6 酶添加量与时间对鲐鱼头水解度的影响Fig.6 Response surface showing the effect of enzyme dosage and time on the DH of P. japonicns heads

用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，其因素和全体自变量之间的线性关系显著(R2= 0.9817)，模型达极显著水平(P＜0.01)，而失拟项F值不显著，说明方程对实验拟合较好，因此用此方程模型来模拟3因素与指标值的关系是可行的。影响水解效果的3个因素加酶量、酶解温度、酶解时间的显著水平均小于0.01，影响效果极显著。

图7 温度与时间对鲐鱼头水解度的影响Fig.7 Response surface showing the effect of temperature and time on the DH of P. japonicns heads

回归方程的特征值存在异号，因此在回归方程所对应的抛物线不存在最大值，需进行岭分析。将酶添加量、酶解温度、酶解时间3个参数分别固定，水解度随其余两个参数变化的趋势如图5～7所示。由图5～7可知：随着酶添加量与酶解时间的增加，酶解液的水解度不断提高，但都趋于平缓；随着酶解温度的升高，水解度先升高后下降。经响应面岭分析得出3个影响因素的最佳组合为酶添加量1311U/g、温度46℃、反应时间7h，此时的水解度达到31.31%。为了检验模型预测的准确性，在最佳酶解条件下进行实验，实际测得的水解度为31.18%，可见该模型能较好的预测鲐鱼头的酶解情况。

在上述最佳条件下，得到的鲐鱼头酶解液水解度在31%左右。陈奕华等[17]利用酶法水解鲮鱼头，最佳条件下鲮鱼头的酶解度为30.5%；陈海桂等[18]采用酶水解鲐鱼蛋白制取功能性鱼蛋白粉，得到水解度为32.4%的鲐鱼酶解液；章叶江等[19]双酶水解鲣鱼头，最佳工艺条件下得到的水解度为23.4%，本实验结果与前二者接近，但高于章叶江等得到的鲣鱼头水解度。

3 结 论

选择中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶对鲐鱼头进行酶解，比较其水解度，最终选择风味蛋白酶，并采用响应面法对风味蛋白酶酶解鲐鱼头的3个主要因素酶添加量、温度、时间进行优化。结果表明，酶添加量1311U/g、温度46℃、反应时间7h，水解度达

到最高31.18%，所得的酶解液可喷雾干燥加工成水产动物蛋白粉，经调味后有望制成特殊风味的调味品或经调配制备多肽饮料等，使鲐鱼头变废为宝。

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Enzymolysis of Pneumatophorus japonicns Heads by Using Response Surface Analysis

FU Chun-yan，ZHOU Dan-jun，LU Yan，LIU Bing-bing，YANG Wen-ge*
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The effects of neutral, papain and flavor protease on the degree of hydrolysis of Pneumatophorus japonicns heads were studied, then the enzymolysis conditions of flavor protease were optimized by using response surface method (RSM). The results showed that flavor protease has the best enzymolysis effect. The effect of enzyme dosage, enzymolysis temperature and time on the degree of hydrolysis (DH) were significant. By the RSM transactional analysis, the optimum enzymolysis conditions were optimized as following: enzyme dosage 1311 U/g, enzymolysis temperature 46 ℃ and time 7 h, respectively. The DH was up to 31.18% under the optimum condition.

response surface method；Pneumatophorus japonicns heads；enzymolysis；degree of hydrolysis

S965.327

A

1002-6630(2010)22-0054-05

2010-01-13

浙江省教育厅学科带头人培养专项(2008932)；宁波大学博士基金项目(BSL2008003)

傅春燕(1985—)，女，硕士研究生，研究方向水产品加工与高值化利用。E-mail：fuchunyan1017@126.com

*通信作者：杨文鸽(1966—)，女，教授，博士，研究方向为水产品保鲜加工与高值化利用。E-mail：yangwenge@nbu.edu.cn