影响超氧化物歧化酶活性测定的因素

赵 建，李 想，鲁 政，文 镜,*

(1.北京联合大学 生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100191；2.北京市药品检验所，北京 100035)

影响超氧化物歧化酶活性测定的因素

赵 建1，李 想2，鲁 政1，文 镜1,*

(1.北京联合大学 生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100191；2.北京市药品检验所，北京 100035)

目的：证实在黄嘌呤氧化酶法中影响超氧化物歧化酶(SOD)活性测定的干扰因素及其对保健食品抗氧化功能评价造成误差。方法：用黄嘌呤氧化酶法测定加入白蛋白、总蛋白、甘油三酯、葡萄糖、VC、还原型谷胱甘肽6种物质对SOD检测体系的影响以及小鼠灌胃VC后的SOD比活力值。结果：在黄嘌呤氧化酶法反应体系中，SOD 灭活后依然能够检测到SOD比活力值。白蛋白、总蛋白、甘油三酯、葡萄糖、VC、还原型谷胱甘肽6种物质都对该体系造成干扰。透析能够消除小鼠血清中小分子物质的干扰。结论：由于黄嘌呤氧化酶法检测SOD为非特异性反应，血清中的蛋白质、脂肪、VC、还原型谷胱甘肽等物质都对SOD 活性测定产生干扰而造成正误差。可采用透析的方法去除血清中含有对SOD检测体系构成干扰的小分子物质。

抗氧化保健食品；功能评价；超氧化物歧化酶；检测方法

超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属酶，它是重要的氧自由基清除剂，能特异地清除超氧阴离子自由基，抑制超氧自由基的氧化作用，因而具有抗氧化、防动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗幅射等功能[1]。目前SOD活性的检测指标被应用在保健食品抗氧化和对辐射危害有辅助保护功能的功能评价当中[2]。测定SOD活性方法有很多，如黄嘌呤氧化酶法、简易凝胶扩散法、邻苯三酚自氧化法、化学发光法、荧光动力学法和酶联免疫法等[3-7]。目前我国保健食品功能评价标准中规定了SOD活性检测采用黄嘌呤氧化酶法[2]。由于该方法的非特异性，在应用中如果不对样品进行选择或进行必要的前处理，样品中的杂质会给测定结果带来很大误差。本实验研究黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性时可能存在的干扰因素，旨在为准确测定酶活性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用中国医学科学院实验动物研究所繁育场[许可证号：SCXK(京)2004-0001]繁殖的昆明种25～28g健康清洁级雌性小鼠25只。实验动物饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品检测中心SPF级动物室，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2007-0020。

盐酸羟胺 北京化工厂；黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、对氨基苯磺酸、甲萘胺 北京北方伟业发展有限公司；VC 广东西陇化工厂；还原型谷胱甘肽 上海丽珠东风生物技术有限公司；SOD标准品(6000U/mg) 北京Biodee 生物有限公司；总蛋白校准液(7.0g/100mL)、白蛋白校准液(4.0g/100mL)、甘油三脂校准液(2.26mmol/L)、葡萄糖校准液(5.55mmol/L) 中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

UV2450可见-紫外分光光度计 日本岛津公司；DS电热恒温水浴锅 北京市医疗设备厂；BP211D赛多利斯电子天平(精度0.00001g) 赛多利斯公司；透析袋(型号：D27，孔径：12000～14000D) 上海肯强仪器有限公司；超纯水系统(PALL PURELAB Plus-Pr015XXM/ PL5123) PALL公司；微量移液器 Eppendorf 公司。1.3方法

1.3.1 SOD比活力的测定

将一定量样品加入含有 pH7.8的1/15mol/L磷酸缓冲液1.0mL的测定管中，然后依次加入10mmol/L盐酸羟胺0.1mL，7.5mmol/L黄嘌呤0.2mL，0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶0.2mL，双蒸水0.49mL，用漩涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴30min后，再加入0.33%对氨基苯磺酸2.0mL，0.1%甲萘胺2.0mL，混匀15min，倒入1cm比色杯，蒸馏水调零，530nm波长处比色测定吸光度。实验同时设一对照管，用等量蒸馏水代替样品，其他操作同测定管中的实验步骤。SOD比活力(每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U))的计算如下式：

式中：A0为对照管吸光度；A1为测定管吸光度；V0为反应液体积；V1为所取样品体积；n为样品测定前的稀释倍数。

1.3.2 SOD加热灭活实验

1.3.2.1 血清加热实验

取5只小鼠血清，并将每只小鼠血清分为加热血清与不加热血清。其中加热血清分别放置于5支试管中沸水浴加热5min，使血清中的酶全部失活，然后取加热后的血清20μL，分别加入到SOD检测体系中进行测定。未加热的血清分别取20μL加入到SOD检测体系中与加热血清平行测定。

1.3.2.2 标准SOD加热实验

将质量浓度为1μg/mL和2μg/mL的SOD标准溶液沸水浴中加热5min，使酶全部失活，然后分别取灭活的SOD 30μL，加入到SOD检测体系中进行测定。

1.3.3 血清中干扰物质对SOD检测体系的影响

选择白蛋白、总蛋白、甘油三酯、葡萄糖、VC、还原型谷胱甘肽6种存在于血清中并可能对SOD检测体系构成干扰的物质，分别取样将其加入到SOD检测体系中，观察其对SOD检测体系的干扰情况。

1.3.4 透析对灌胃VC干扰的排除

将20只小鼠分为VC组和对照组，每组10只。VC组每只小鼠灌胃10mmol/L的VC 0.5mL，对照组每只小鼠灌胃0.5mL蒸馏水，0.5h后眼眶取血，静置5min后离心，将离心后血清分为对照组透析血清、对照组未透析血清、VC组透析血清和VC组未透析血清，透析血清加入到截留分子量为12000～14000D的透析袋中，用去离子水在4℃条件下透析3h，透析后测定SOD比活力。

2 结果与分析

2.1 SOD加热灭活实验

2.1.1 血清加热实验

表1 加热血清与正常血清SOD比活力比较 (x±s)Table 1 Comparison of SOD specific activity between heated serum and normal serum (x±s)

由表1可知，加热血清后，血清中的酶全部失活，但仍能测出SOD比活力，说明血清中除SOD外还存在其他对黄嘌呤氧化酶反应体系产生反应的物质。这些物质对SOD的测定会造成干扰。

2.1.2 标准SOD加热实验

表2 标准SOD加热失活后所测出的SOD比活力Table 2 Specific activity of standard SOD with heating inactivation

由表2可知，标准SOD加热失活后，依然能够检

测出SOD比活力，且大小与质量浓度呈现正相关。说明即使失活的SOD蛋白对检测体系也会造成干扰。

2.26 种干扰物质对SOD检测体系的影响

表3 6种干扰物质对SOD检测体系的影响Table 3 Effects of interference substances on SOD detection system

6种干扰物质的质量浓度是按照文献[8]中关于人血清相关营养素的含量制定的。表3显示，6种物质加入到黄嘌呤氧化酶反应体系中均能测出SOD比活力。在6种干扰物质中，白蛋白和总蛋白SOD比活力最高。

2.3 透析对SOD比活力测定时VC干扰的排除

表4 透析与未透析对灌胃VC组和对照组小鼠SOD比活力测定的影响Table 4 Effects of dialyzed and non-dialyzed vitamin C samples on SOD specific activity in mice treated with gastric perfusion of vitamin C and the control

从表4可知，对照组血清透析后血清中SOD比活力比未透析下降了10%。透析除去了血清中的小分子物质，而将SOD等大分子物质保留下来。结果说明血清中含有对SOD检测体系构成干扰的小分子物质，采用透析的方法可以去除这些小分子干扰物质。灌胃VC组未透析血清SOD比活力与对照组未透析比较，其小鼠血清SOD比活力提高了8.3%。结果说明一次性灌胃VC后能够使血清SOD比活力测定值升高。由于VC只是在取血前0.5h一次性灌胃，在这样短的时间里不可能对SOD的增加产生影响，因此SOD比活力提高是由于血清中VC含量增加，直接作用于黄嘌呤氧化酶反应体系中产生的自由基而所造成的一种假象。通过对灌VC后的血清进行透析，干扰被清除。血清经过透析将VC和其他一些小分子物质排除后，与对照组透析的血清SOD比活力比较，差别不明显，说明用透析的方法可以排除由于灌胃VC给SOD检测带来的干扰。

3 讨 论

从黄嘌呤氧化酶法测定样品中SOD比活力的实验原理中可以看到，除SOD之外只要反应体系中加入能够与超氧阴离子自由基发生反应的分子，都会对最终的颜色变化造成影响。这就意味着当样品中除SOD之外还有能与超氧阴离子自由基发生反应的物质就会对结果造成干扰。

通过血清加热实验证实了当血清中的酶灭活后，在此反应体系中依然测出了SOD比活力，显然这一结果是由于血清中其他干扰成份造成的。

标准SOD加热实验的结果说明即便是纯SOD，当加热使其失活后，仍然能够在此反应体系中测出SOD比活力值。显然这是一部分超氧阴离子自由基与变性蛋白反应造成的 。

为了进一步评价血清中其他物质对SOD活性测定的影响，本实验依据文献[8]中表述的血清中6种常见物质的含量，分别用黄嘌呤氧化酶法对其进行测定，发现均能测出SOD比活力。其中蛋白质的干扰最大，可能与其在血清中的质量浓度较高和蛋白质本身带有的一些化学基团更容易与超氧阴离子自由基反应有关。

目前我国保健食品功能检测的部颁标准规定使用黄嘌呤氧化酶法检测动物血清或组织中SOD比活力，由于方法中未对样品进行充分的前处理，因此其检测结果会有较大误差。但保健食品功能检测是一种比较法，即将摄食与未摄食保健食品的动物进行比较。由于除保健食品的摄入外，两组动物在来源，饮食及饲养环境等各方面条件基本一致，因此两组动物的SOD比活力测定干扰成份引起的误差相差不大，将两组结果进行比较，保健食品的功能还是能够被反映出来。只不过测定出的SOD比活力与真实值的差距较大，且为正误差。

尽管目前的实验方法能够将有效提高SOD比活力的保健食品与对照组区别出来。但是由于这种检测方法的非特异性，为保健食品的造假带来可乘之机。从表4可以看到，只是在取血前30min一次性给小鼠灌胃VC，就能使SOD比活力比对照组提高8.3%，显然这是由于血清中VC含量增加给SOD检测带来的正误差而所造成的一种假象。如果抗氧化保健食品造假掺入了小分子的化合物，采用透析是解决这个问题的一种方法。

[1]桂兴芬, 杨萍, 刘隽, 等. 饮品中超氧化物歧化酶的活性及影响因素[J]. 郑州工程学院学报, 2000, 21(4)∶ 67- 68.

[2]保健食品检验与评价技术规范[S]. 2003.

[3]李革新, 郑全美. 三种SOD测定方法的比较[J].中国卫生检验杂志, 1999, 6(5)∶ 273-274.

[4]杨磊, 陈冠华, 崔建超, 等. 荧光动力学法测定超氧化物歧化酶的活性[J]. 分析化学研究报告, 2008, 36(4)∶ 489-493.

[5]储海虹, 吴莹, 狄俊伟, 等.电化学发光淬灭法测定SOD[J]. 分析测试学报, 2006, 25(1)∶ 125-126.

[6]廖展如, 陈文学, 艾常春, 等. 邻苯三酚自氧化法适于测定SOD活性吗？[J]. 华中师范大学学报∶ 自然科学版, 2003, 37(1)∶ 59-63.

[7]傅崇岗, 杨冬芝. 电泳中介微分析法测定超氧化物歧化酶[J]. 分析化学研究简报, 2006, 34(4)∶ 517-520.

[8]何志谦. 人类营养学[M]. 北京∶ 人民卫生出版社, 2000.

Factors Affecting the Determination of Superoxide Dismutase Activity

ZHAO Jian1，LI Xiang2，LU Zheng1，WEN Jing1,*
(1. Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China；2. Beijing Institute for Drug Control , Beijing 100035, China)

Objective∶ To verify the factors for affecting the determination of superoxide disutase (SOD) activity in xanthine oxidase method and the evaluation error for antioxidant functions of healthy food. Methods∶ Effects of the addition of albumin, total protein, triglyceride, glucose, vitamin C and glutathione on SOD determination in xanthine oxidase method and on specific activity of SOD in mice treated with vitamin C through gastric perfusion. Results∶ In xanthine oxidase method, the specific activity of SOD still could be detected although SOD was inactivated. The addition of above six substances could disturb determination results of SOD activity. However, dialysis could eliminate the interference from small molecular substances in serum. Conclusion∶ Xanthine oxidase method for detecting SOD activity is a non-specific method. Protein, fat, vitamin C and glutathione in serum can affect SOD activity to result in a positive error. Dialysis is a simple and effective method to remove these interference substances.

antioxidant healthy food；functional evaluation；superoxide dismutase；detection method

TS207.3

A

1002-6630(2010)09-0216-03

2009-07-16

北京市教委重点实验室引导基金项目(21202543503)

赵建(1972—)，男，工程师，本科，主要从事保健食品功能评价研究。E-mail：zhaojian@ygi.edu.cn

*通信作者：文镜(1952—)，男，教授，本科，主要从事保健食品功能学评价机理和方法学研究。E-mail：wenjing@ygi.edu.cn