不同乳酸菌菌株抗氧化能力的比较研究

王 曦，罗 霞，许晓燕，余梦瑶，喻春莲，江 南，曾 瑾，杨志荣,*

(1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川 成都 610065；2.四川省中医药科学院，四川 成都 610041；3.四川省农业科学院，四川 成都 610066)

不同乳酸菌菌株抗氧化能力的比较研究

王 曦1，罗 霞2，许晓燕2，余梦瑶2，喻春莲3，江 南2，曾 瑾2，杨志荣1,*

(1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川 成都 610065；2.四川省中医药科学院，四川 成都 610041；3.四川省农业科学院，四川 成都 610066)

目的：比较不同乳酸菌菌株的抗氧化能力，为其天然抗氧化剂的开发提供理论依据。方法：通过羟自由基清除实验，超氧阴离子自由基清除实验，DPPH自由基清除实验以及还原能力测定实验，对35株乳酸菌的菌体、无细胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力进行研究。结果：比较发现La 5和La 29两株乳酸菌抗氧化能力相对较高。结论：不同来源的乳酸菌菌株还原能力不同，且在羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除能力方面存在差异；且其发挥抗氧化作用的活性物质存在的部位也因菌株的不同而具有较大的差异性。

乳酸菌；抗氧化能力；自由基；还原能力

自由基是一类带有未配对电子的离子、原子、分子的基团，在生物体内正常代谢时所产生的副产物，随着年龄的增长，生物体内自由基的增加将导致机体的损伤。研究表明：人类的衰老[1-2]及一些疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病等[3-5]都与自由基的产生有关。开发抗氧化剂，加强机体的抗氧化能力，对清除机体自由基、保护细胞免受损伤具有非常重要的意义。随着人们对抗氧化剂研究的深入，对人工合成抗氧化剂的安全性问题提出质疑[6]。因此，从自然界寻求天然抗氧化剂的研究已成为热点。

目前研究表明，乳酸菌具有许多的保健功能，如抗癌[7-10]、健胃整肠[8]、抗氧化[8]、抑菌抗病[9-10]。作为天然抗氧化剂的一种，乳酸菌的抗氧化能力一直受到人们的重视。研究已经证明，一些乳酸菌具有抗氧化活性，但在对乳酸菌的抗氧化能力研究中，对象多是针对某一株或几株菌株，较少广泛比较不同属乳酸菌，同时也缺乏对其活性物质存在部位全面、具体的分析比较。张凤敏等[11]只对L1001、F12这两株乳酸菌的菌体及无细胞提取物清除DPPH自由基的能力作相关研究。张江巍等[12]仅对L3和L4两株乳酸菌的无细胞提取物抗氧化能力进行检测分析。

本研究就是通过羟自由基清除实验、超氧阴离子自

由基清除实验、DPPH自由基清除实验以及还原能力测定实验，对不同来源的35株乳酸菌的菌体、无细胞提取物及胞外分泌物的抗氧化能力进行检测、比较。以了解不同乳酸菌抗氧化能力的高低及其活性物质存在的主要部位，这样既可以根据不同要求选择理想的乳酸菌菌株和菌株的具体利用部位，也为合理利用开发乳酸菌抗氧化制剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌株

35株乳酸菌菌株，编号为：La 1～La 35。La 1～La 15属于乳杆菌属(Lactobacillus)，La 16～La 33属于链球菌属(Strptococcus)，La 34、La 35属于明串珠菌属(Pedicocus)，由四川省中医药科学院分离、保存。

1.1.2 试剂与培养基

二苯代苦味肼基自由基(DPPH) Sigma公司；邻二氮菲、铁氰化钾、邻苯三酚、过氧化氢、Tris-Base、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、三氯乙酸、三氯化铁等试剂均为国产分析纯。

培养基：M R S培养基。

1.2 仪器与设备

T6紫外-可见分光光度计 中国北京普析通用仪器有限责任公司；Centrifuge 5810R冷冻高速离心机 美国Eppendorf公司；DELTA320 pH计 美国梅特勒-托利多仪器有限公司；LDZX-50KBS压力蒸汽灭菌器 中国上海申安医疗器械厂；UH-800A UH系列超声波细胞粉碎仪 美国Autoscience Instrument公司；ZHWY-2118恒温培养振荡器 中国上海智城分析仪器制造有限公司；H-HB-11360-BS培养箱 中国上海跃进医疗机械厂。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的培养

乳酸菌菌株于37℃在MRS培养基斜面上活化培养24 h，再以10%接种量接种于MRS液体培养基，37℃静止培养24h。

1.3.2 样品的制备

1.3.2.1 菌体的制备

培养24h后，发酵液5000r/min离心15min，收集菌体，并用双蒸水洗涤3次，最后用双蒸水将乳酸菌的菌数调整到1010cells/mL，即为待测样品。

1.3.2.2 胞外分泌物的制备

培养24h后，收集发酵液，用双蒸水将乳酸菌的菌数调整到1010cells/mL，在5000r/min转速下离心15min，收集上清液，即为胞外分泌物。

1.3.2.3 无细胞提取物的制备

培养24h后，发酵液5000r/min的转速下离心15min，收集菌体，并用双蒸水洗涤3次，将乳酸菌的菌数调整到1010cells/mL，再在冰浴中超声破碎细胞，破碎液于6000r/min离心10min，收集上清，即为待测样品。

1.3.3 乳酸菌抗氧化活性的检测

1.3.3.1 清除羟自由基实验

参照文献正文中的方法[13-14]，并略有改进如下：在试管中分别加入1mL的0.05mol/L，pH 7.4的磷酸缓冲液，0.5mL 6m mol/L的邻二氮菲，充分混匀后，加入0.5mL 6mmol/L的FeSO4溶液，加入后立即混匀。然后向其中加入0.5mL的样品溶液，混匀，再加入0.5mL 0.1%的H2O2，最后补充体积到4mL，同时做空白实验。另再做损伤管和未损伤管，其中，损伤管中加入0.5mL 0.1%的H2O2，未损伤管不加H2O2，最后均将体积补充到4mL。于37℃保温1h，测其在536nm波长处的吸光度。

式中：A为不加样品时溶液的吸光度；A0为不加样和H2O2时溶液的吸光度；Ai为加样品时溶液的吸光度。

1.3.3.2 清除超氧阴离子自由基实验

[15-16]中的方法，并略有改进如下：取2mL的50mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液，与0.91mL H2O，50μL样品，混均后加入40μL浓度为10mmol/L的邻苯三酚溶液，记录其在320nm波长处的吸光度。计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。

式中：△A0为空白溶液的吸光度随时间的变化；△A为样品溶液的吸光度随时间的变化。

1.3.3.3 清除DPPH实验

参照文献[17-19]中的方法，并略有改进如下：1mL待测液加1mL浓度为0.2mmol/L的DPPH，室温下静置30min后，在517nm波长处测吸光度变化。

式中：Ai为1mL的DPPH+1mL样品的吸光度；Aj为1mL溶剂+1mL样品的吸光度；A0为1mL DPPH+1mL溶剂的吸光度。

1.3.3.4 还原能力的检测方法

参考文献[20-21]中的方法，并略有改进如下：取0.5mL样品加入浓度为0.2mol/L，pH 6.6的磷酸缓冲溶液0.5mL及1g/100mL铁氰化钾0.5mL，于50℃水浴20min，急速冷却。再加入10g/100mL三氯乙酸0.5mL，3000r/min离心5min，取上清液1mL，加入1mL蒸馏水及1mL 0.1g/100mL三氯化铁，混合均匀。10min后，于700nm波长测定其吸光度。吸光度越大表示待测样品的还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌对羟自由基清除能力的比较

邻二氮菲-Fe2+水溶液在该反应中作为氧化还原指示剂，其颜色变化可反应样品氧化还原的状态。体系中H2O2与Fe2+通过Fenton反应，产生具有很强氧化性的羟自由基，若向其中加入羟自由基清除剂，羟自由基的浓度减少，Fe2+浓度增加，体系吸光度也相应升高。因此，可以根据加入样品前后吸光度的变化来反应羟自由基的增加或减少。

表1 乳酸菌菌体羟自由基清除率Table 1 Scavenging capability of lactic acid bacteria to hydroxyl free radicals

本实验对35株菌株的菌体、无细胞提取物和胞外分泌物的羟自由基清除能力进行了研究。这35株乳酸菌无细胞提取物的羟自由基清除率均为零，胞外分泌物的羟自由基清除能力较弱，仅菌体表现一定的清除能力。由表1可知，不同乳酸菌对羟自由基的清除能力差异很大。其中La 4和La 5这两株菌株的菌体具有相当强的清除羟自由基能力，清除率分别为91.022%和98.460%。而其余33株乳酸菌的清除率均较低，小于20%，La 31的羟自由基清除率最低，仅为1.301%。分析其原因可能是不同乳酸菌清除羟自由基的活性物质不同或活性物质含量不同。同时检测出乳酸菌的不同部位抗氧化的能力也不同：无细胞提取物无清除能力，而菌体的清除能力较强。这表明乳酸菌菌体的表面组成成分中有较多清除羟自由基的活性物质。

2.2 乳酸菌对超氧阴离子自由基清除能力的比较

该反应体系中的邻苯三酚在碱性条件下自氧化，产生超氧阴离子及有色中间产物，加入超氧阴离子清除剂后会抑制有色产物的产生，因此可以通过比色法进行定量分析。

表2 乳酸菌胞外分泌物的超氧阴离子自由基清除率Table 2 Scavenging capability of extracellular secretion from lactic acid bacteria to superoxide anion free radicals

结果表明只有其中3株乳酸菌的无细胞提取物和19株乳酸菌的菌体具有微弱的超氧阴离子自由基清除能力，清除率范围在0.1%～1.77%。而全部乳酸菌的胞外分泌物均检测出具有一定的清除能力。由表2可知，有19株乳酸菌胞外分泌物的清除率大于50%，其中La 29的胞外分泌物超氧阴离子自由基清除率最高，达到98.971%。同时也检测出，La 17的清除能力最弱，清除率仅为8.199%。实验表明，清除超氧阴离子自由基的活性物质主要存在于乳酸菌的代谢分泌物中。

2.3 乳酸菌对DPPH自由基清除能力的比较

DPPH自由基是一种常见的筛选和评价抗氧化剂的有效方法，该法广泛用于自由基清除剂的筛选研究。

检测结果表明乳酸菌的菌体DPPH自由基清除率均为零，没有显示出具有清除DPPH自由基的能力，而胞外分泌物和无细胞提取物表现出一定的清除能力。由表3可知，乳酸菌的胞外分泌物和无细胞提取物对清除D P P H自由基的能力差异较大，清除率的范围在0.031%～98.153%，且除La 5外的所有乳酸菌胞外分泌物清除率高于其无细胞提取物。乳酸菌中胞外分泌物清除率最大的是La 29，为51.351%，最低的是La 1，为6.017%。乳酸菌无细胞提取物清除率最大的是La 5，达到98.153%，同时检测到，其余34株乳酸菌的无细胞提取物清除率很低，最低的是La 22，为0.031%。这说明，乳酸菌清除DPPH自由基的活性物质可能是代谢分泌物，细胞内物质也有一定的活性物质。

表3 乳酸菌菌株胞外分泌物和无细胞提取物的DPPH自由基清除率Table 3 Scavenging capabilities of extracellular secretion from lactic acid bacteria and cell-free extract to DPPH free radicals

2.4 乳酸菌还原能力的比较

铁氰化钾(K3Fe(CN)6)在pH值为6.6的磷酸缓冲液提供的弱酸环境下，还原生成黄血盐(K4Fe(CN)6)，其再与三氯化铁提供的三价铁离子作用生成普鲁士蓝(Fe4[Fe (CN)6]3)。还原能力是以测定普鲁士蓝的生成量为指标，以其在700nm波长的吸光度大小来测定物质的还原能力大小。A700nm越大，其还原能力越大。

表4 乳酸菌菌株胞外分泌物的还原能力Table 4 Reducing powder of extracellular secretion from lactic acid bacteria

检测结果表明所有乳酸菌均表现一定的还原能力，A700nm的范围在0.001～3.169，而乳酸菌的胞外分泌物还原能力相对较强，由表4可知，La 2 9的胞外分泌物还原能力最强，A700nm为3.168；而La 12的还原能力最低，A700nm仅为0.029。实验表明：乳酸菌具还原能力的活性物质存在于细胞内，菌体表面及代谢分泌物中。但不同乳酸菌活性物质含量或存在部位不同。

3 讨 论

近年来，乳酸菌抗氧化的研究逐渐引起科学家的广泛重视，但相关报道不多，具体研究内容包括两种模型：体内抗氧化实验和体外抗氧化实验。体内抗氧化实验主要是用抗氧化剂喂食动物，检测其血液和组织中主要的抗氧化酶，如超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等的活性及含量[6]。本研究主要是对不同乳酸菌菌株的体外抗氧化模型的3种自由基清除率及还原能力进行测定。目前研究乳酸菌无细胞提取物的抗氧化性较多，但没有具体比较分析抗氧化活性物质的分布部位，本实验在比较不同乳酸菌抗氧化能力的同时，也研究不同菌株抗氧化活性物质的分布部位。

实验表明，La 5的菌体对羟自由基清除率最高(98.460%)，其无细胞提取物对DPPH自由基具有最高的清除率(98.153%)；La 29的胞外分泌物对超氧阴离子自由基清除率最高(98.971%)，并且还原能力也最强，A700nm为3.168。由此，筛选得到La 5和La 2 9两株抗氧化能力相对较强的乳酸菌菌株，可用于抗氧化剂的进一步开发应用。

通过研究还发现，不同乳酸菌菌株的抗氧化能力存在差异，可能是起抗氧化作用的活性物质本质或浓度不同；并且，同一株乳酸菌的菌体、无细胞提取物及胞外分泌物的抗氧化能力也存在较大差异，这揭示了其抗氧化的活性物质存在于不同部位；同时，由于不同的菌株其还原能力及清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基能力的不同，导致其抗氧化机制有所差异。

目前对乳酸菌抗氧化能力的研究和利用多是针对活菌体及无细胞提取物，然而本研究表明，抗氧化活性物质较多分布在乳酸菌胞外分泌物中，菌体和无细胞提取物分别只对羟自由基、DPPH自由基有相对强的清除能力。因此，以后进一步的产品开发中，乳酸菌体外分泌物可作为研究重点。乳酸菌抗氧化制剂的研发应该根据其产品的开发特点，并结合菌株自身的优势有目地的对其进行选择，以利于开发出生产成本低廉、疗效明确的符合市场需求的抗氧化制剂产品。

在本研究的基础上，我们将筛选出的有效菌株La 5、La 29进一步做体内抗氧化模型，同时分析乳酸菌抗氧化的物质基础，分离研究抗氧化活性物质，并对目前尚不太清除的乳酸菌抗氧化作用机制作深入研究。同时，因为抗氧化与许多疾病紧密联系，可将筛选出的优良安全菌株开发成具保健功能的产品，对丰富乳酸菌附加值具有重要的意义。

参考文献：

[1]李素云, 王立芹, 郑嫁琳, 等. 自由基与衰老的研究进展[J]. 中国老年杂志, 2007, 27(20)∶ 2046-2048.

[2]陈会良, 商常发. 抗衰老中药对自由基清除作用的研究进展[J]. 中国中医药杂志, 2007, 5(8)∶ 14-17.

[3]钟秀倩. 氧自由基与疾病[J]. 韶关学院学报∶自然科学版, 2006, 27 (6)∶87-90.

[4]HENSLEK K, ROBINSOK K, GABBITA S P, et al. Reactive oxygen species, cell signaling, and cell injury[J] Free Radical Biology and Medicine, 2000, 28(10)∶ 1456-1462.

[5]李勇, 孔令青, 高洪, 等. 自由基与疾病研究进展[J]. 动物医学进展, 2008, 29(4)∶ 85-88.

[6]徐清萍, 钟桂芳, 孟君. 抗氧化剂抗氧化方法研究进展[J]. 食品工程, 2007(2)∶ 23-25.

[7]刘宇, 孟祥晨. 乳酸菌胞外多糖及其抗肿瘤活性[J]. 中国乳品工业, 2008, 36(1)∶ 39-43.

[8]王娇. 乳酸菌生理功能的研究进展[J]. 四川食品与发酵, 2005, 41(2)∶43-46.

[9]赵龙飞. 乳酸菌的保健功能及其在食品中的应用研究[J]. 中国调味品, 2009, 34(6)∶30-33.

[10]安永福. 浅谈乳酸菌及其特点[J]. 中国奶牛, 1995(5)∶ 50-51.

[11]张凤敏, 田丰伟, 陈卫, 等. 具抗氧化活性乳酸菌的筛选[J]. 中国乳品工业, 2007, 35(2)∶ 4-7.

[12]张江巍, 曹郁生, 李海星, 等. 乳酸菌抗氧化活性及检测方法[J]. 中国乳品工业, 2005, 33(9)∶ 53-56.

[13]王宁, 薛源, 孙体健. 苋菜红色素对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用[J]. 山西医科大学学报, 2009, 40(5)∶ 458-460.

[14]LUO Yangchao, CHEN Gang, LI Bo, et al. Evaluation of antioxidative and hypolipidemic properties of a novel functional diet formulation of Auricularia auricula and hawthorn[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009, 10(2)∶ 215-221.

[15]CHARLES A L, HUANG T C. Sweet cassava polysaccharide extracts protects against CCl4liver injury in wistar rats[J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23∶ 1494-1500.

[16]孔浩, 张继. 杏仁油及葡萄籽油清除自由基能力研究[J]. 甘肃科技, 2008, 24(6)∶ 57-58.

[17]吴平格, 杨怀霞, 陈志红, 等. DPPH·法评价葡萄籽梯度渗漉各组分的抗氧化性能[J]. 食品科技, 2005(10)∶ 40-42.

[18]张晓璐, 徐凯宏. 山楂叶总黄酮清除DPPH·和超氧阴离子自由基的活性研究[J]. 林业科技, 2008, 33(5)∶ 51-54.

[19]HROMADKOAV Z, KOSTALOVA Z, EBRINGEROV A. Comparison of conventional and ultrasound-assisted extraction of phenolics-rich heteroxylans from wheat bran[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2008, 15∶1062-1068.

[20]李慎新, 曹新志, 钟俊波, 等. 几种中草药抗氧化性成分的还原能力及总酚含量比较研究[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(29)∶ 12755-12756.

[21]ZOU Chang, DU Yumin, LI Yan, et al. Preparation of lacquer polysaccharide sulfates and their antioxidant activity in vitro[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 73∶ 322-331.

Comparative Studies on Antioxidant Activities of Different Lactic Acid Bacterial Strains

WANG Xi1，LUO Xia2，XU Xiao-yan2，YU Meng-yao2，YU Chun-lian3，JIANG Nan2，ZENG Jin2，YANG Zhi-rong1,*
(1. Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment of Ministry of Education, College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610065, China；2. Sichuan Province Chinese Medicine Institute, Chengdu 610041, China；3. Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

Objective∶ In order to provide theoretical evidences for developing novel natural antioxidants, antioxidant activities of different lactic acid bacterial strains were compared in this paper. Methods∶ The antioxidant capabilities and reducing activities of 35 lactic acid bacterial strains from intact cells, cell-free extracts and extracellular secretions were evaluated through scavenging capabilities of hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals. Results∶ La 5 and La 29 displayed the excellent antioxidant activity among 35 lactic acid bacterial strains. Conclusion∶ Different fractions from lactic acid bacteria have different scavenging capabilities in vitro. Therefore, lactic acid bacteria from difference resources, concentrations and excretion places also exhibited different antioxidant activities.

actic acid bacteria；antioxidant activity；free radicals；reducing activity

Q949.91

A

1002-6630(2010)09-0197-05

2009-08-06

四川省青年科技基金项目(08ZQ026-014)

王曦(1985—)，女，硕士研究生，主要从事微生物研究。E-mail：micwxi@163.com

*通信作者：杨志荣(1951—)，男，教授，主要从事资源微生物研究。E-mail：bioyang@163.com