大蒜素对人宫颈癌Hela细胞增殖影响及其作用机制

张敏 郭亮

大蒜素(Allicin)是大蒜中主要生物活性成分的总称，是从大蒜鳞茎中分离出的具有多种生物学活性的化合物。现代医学研究证实大蒜素具有多种生物活性如(抗菌、消炎、提高机体免疫力和抗肿瘤的作用［1－3］)。体外研究显示，大蒜素可以通过诱导癌细胞生成活性氧(ROS)，上调 Bax和 Bak，激活Caspase-3等方式促进其凋亡［4，5］。本研究以体外培养的人宫颈腺癌Hela细胞为材料，探讨大蒜素对宫颈癌细胞增殖的影响并研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌Hela细胞由河北医科大学病理教研室提供;大蒜素(二烯丙基代磺酸酯)购于河北医科大学第二临床医院药房;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Ho33342、碘化丙啶(PI)为美国Sigma产品;DMEM、新生牛血清为美国Gibco产品;Bcl-2、Bax单克隆抗体购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:人宫颈癌Hela细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下静置培养。选择对数生长期细胞进行分组实验。

1.2.2 MTT法检测大蒜素对细胞增殖的影响:细胞以5×104/ml的密度接种于96孔培养板中，培养48 h后，每孔加入不同浓度的大蒜素各 100 μl，浓度分别为 1、5、10、20 μg/ml，对照组加入含10%FBS的培养基，分别培养12、24、48 h后，分别向每孔加入20μl MTT(5 mg/ml)溶液，继续培养4 h，弃培养液，每孔加入 DMSO 100μl，振荡5 min;酶标仪检测(吸光度为550 nm)。每时间浓度组设3个复孔，实验重复3次。所得OD值根据公式计算细胞抑制率。细胞抑制率(%)=(1－OD实验组/OD正常组)×100%，以空白组OD值调零。

1.2.3 大蒜素诱导宫颈癌:Hela细胞凋亡最适浓度筛选以上各实验组加入大蒜素作用24 h，加入Ho33342(浓度10μg/ml)37℃温育20 min，再加入PI(浓度50μg/ml)，荧光显微镜观察并记录图象。

1.2.4 细胞形态学观察:10μg/ml大蒜素分别作用0～24 h，每隔2 h显微镜观察1次，随机选取视野记录图象。

1.2.5 流式细胞仪检测:大蒜素对细胞周期的影响:细胞以5×104/ml－1接种于 25 cm2培养皿中，培养 48 h 后，加入10 μg/ml大蒜素，分别培养 12、24 h，弃培养液，加入 0.25% 胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心8 min收集细胞。细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后，500μl PBS悬浮细胞，加入含10μg/ml的 RNase的 PI，4℃染色30 min。经200目滤网过滤后，上机检测。实验结果采用Modifit软件进行细胞周期各期的百分率分析。实验重复3次。

1.2.6 流式细胞仪检测大蒜素对Bcl-2和Bax的影响:细胞以5×104/ml接种于25 cm2培养中，培养48 h后，加入10μg/ml大蒜素分别培养12和24 h，收集细胞，以PBS清洗3次，70%乙醇4℃固定1 h。经PBS再次清洗后，不同时间组细胞分别加入兔抗人Bcl-2或兔抗人Bax一抗，37℃孵育1 h，PBS清洗后加入FITC标记山羊抗兔二抗，37℃避光孵育20 min。阴性对照PBS代替一抗。PBS清洗3次后上流式细胞仪检测，实验重复3次。

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.0统计件，计量资料以x¯±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜素对宫颈癌Hela细胞活性的影响 MTT结果显示1～10μg/ml大蒜素均能抑制Hela细胞的增殖 ，呈时间-剂量依赖性关系;20μg/ml大蒜素细胞毒性作用明显，作用12 h，细胞抑制率为74.71%，作用24 h以后细胞几乎全部死亡。见表1。

表1 大蒜素对Hela细胞增殖的抑制作用n=6，%，¯x±s

2.2 大蒜素诱导宫颈癌 Hela细胞凋亡最适浓度的筛选Ho33342和PI染色结果提示，各浓度组中，10μg/ml大蒜素对Hela细胞诱导凋亡作用最明显;20μg/ml大蒜素主要表现为细胞毒性作用。因此，本实验选取10μg/ml作为最适诱导浓度来探讨其作用机制。

2.3 细胞形态学观察正常条件下Hela细胞呈梭形或多角形，传代培养48 h，细胞贴壁生长，有聚团现象;10μg/ml大蒜素作用6 h，细胞开始出现形态学改变，紧贴瓶壁的细胞边界模糊，部分细胞缩起，分裂相减少;大蒜素作用12 h开始有凋亡小体出现;大蒜素作用24 h，大部分细胞回缩变圆，凋亡小体明显，部分细胞悬浮于培养基中，细胞碎片增多。

2.4 大蒜素对细胞周期影响流式细胞仪检测结果显示，10μg/ml大蒜素作用12 h，Hela细胞凋亡率为 16.73%;作用24 h细胞凋亡率为24.03%。细胞周期均发生了明显的变化，主要表现为G0/G1期细胞减少，G2/M期细胞增加，而S期细胞无明显变化。

2.5 流式细胞仪检测Bcl-2和Bax表达结果显示，10μg/ml大蒜素作用12和24 h，可降低癌基因蛋白 Bcl-2表达(P＜0.01)，而促进 Bax表达 (P ＜0.01)。见表2。

表2 10μg/ml大蒜素诱导后不同时间Hela细胞Bcl-2和Bax表达¯x±s

3 讨论

本研究采用的大蒜素主要含三硫二丙烯，选择人宫颈癌Hela细胞进行抑制增殖和诱导凋亡的研究，并初步探讨了其作用机制。

细胞周期在肿瘤细胞的生长调控中具有重要作用，通过改变细胞周期来阻止肿瘤细胞的增殖已受到人们关注［6－8］。本研究发现，大蒜素作用后G1期Hela细胞明显减少，G2/M期相对增多。其原因是大蒜素抑制G2/M期，使多数细胞不能通过M期向G1期的转变，导致G1期细胞减少，使大量细胞停滞在M期，无法完成正常的有丝分裂，提示大蒜素对Hela细胞有周期特异性抑制作用;大蒜素对Hela细胞M期有阻滞作用，对临床应用大蒜素防治宫颈癌，尤其与周期特异性化疗药物辅助应用治疗宫颈癌具有重要的理论意义。Bcl-2家族在细胞凋亡中起着重要的作用，其家族成员包括抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl等，促凋亡蛋白Bax、Bbad等。Bcl-2和Bax分别可以同源二聚体形式存在，二者之间可以形成异源二聚体。Bax的表达增多时，Bax-Bax的同源二聚体便诱导细胞凋亡;而Bcl-2的表达增多时，Bax和Bcl-2形成更为稳定的异源二聚体来抑制细胞凋亡。Bcl-2/Bax的比率可以调节细胞凋亡的速率［9］。本实验证明经大蒜素处理的Hela细胞，Bax表达升高而Bcl-2水平明显降低。提示大蒜素可通过降低Bcl-2/Bax的比率诱导Hela细胞凋亡。

1 Xiao D，Lew KL，Kim YA，et al.Diallyl trisulfide suppresses growth of PC-3 human prostate cancer xenograft in vivo in association with Bax and Bak induction.Clin Cancer Res，2006，12:6836-6843.

2 Li N，Guo R，Li W，et al.A proteomic investigation into a human gastric cancer cell line BGC823 treated with diallyl trisulfide.Carcinogenesis，2006，27:1222-1231.

3 Zhou Z，Tau HL，Xu BX，et al.Microarray analysis of altered gene expression in diallyl trisulfide-treated HepG2 cells.Pharmacol Rep，2005，57:818-823.

4 王惠兰，张贺玲，袁芳，等.大蒜素单独及与顺铂联合对人宫颈癌Hela细胞生长的影响.实用妇产科，2004，11:349-310.

5 王惠兰，刘影，张晓茗，等.大蒜素与顺铂单独及联合应用对宫颈癌裸鼠移植瘤生长的影响.中华妇产科杂志，2006，41:566-567.

6 Nagata S.Apoptosis by death factor.Cell，1997，88:355-365.

7 Cohen GM.Caspases:the executioners of apoptosis.Biochem J，1997，326:1-16.

8 Alhasan SA，Ensley JF，Sarkar FH.Genistein elicits pleiotropic molecular effects on head and neck cancer cells.Clin Cancer Res，2001，7:4174-4181.

9 Ina K，Itoh J，Fukushima K，et al.Resistance of Crohn’s desease Tcells to multiple apoptotic signals is associated with a bcl-2/Bax mucosal imbalance.J Immunol，1999，163:1081-1090.