家蚕jc油蚕基因座的确定及pe-wb-okc三隐性系的建立①

胡海 李涛 代方银* 夏定国, 赵巧玲* 鲁成

(1.西南大学蚕学与系统生物学研究所,生物技术学院重庆400716;2.中国农业科学院蚕业研究所镇江212018)

家蚕有丰富的突变类型,其中油蚕突变更是独具特色。油蚕的形态特征是:幼虫皮肤呈现透明或者半透明状,像油纸一般。根据油蚕的透明度,可将油蚕分为高度油蚕、中度油蚕和低度油蚕。已知引起油蚕性状的突变基因有40个左右[1-9]。

中国农科院蚕业研究所赵巧玲等[3]在蚕品种东3291的选育过程中发现了一种油蚕自然突变体,命名为jc油蚕(ojc),经过连锁分析ojc基因与红卵(re)基因连锁,属于家蚕第5连锁群,但基因位点未确定。2008年,jc油蚕移送西南大学家蚕基因库进行鉴定,并为定位该突变基因着手培育三隐性系。我们在对jc油蚕的连锁群采用标记基因pe(桃红眼白卵)进行验证的基础上,用该连锁群上与jc油蚕透明度相当的金鸡龙油蚕(ok)进行了杂交鉴定,现将结果简报如下。

1 材料与方法

1.1 材料

jc油蚕:油蚕自然突变,中国农科院蚕业研究所提供。

桃红眼白卵(pe):浆液膜色素橙黄色,成虫复眼淡红色;金鸡龙油蚕(ok):家蚕第5连锁群油蚕突变,幼虫皮肤高度透明;白带黑翅(wb):成虫翅的基部和外缘黑褐色,中间有白带。为西南大学家蚕基因库保存的遗传材料。

1.2 方法

ojc与ok杂交,根据F1、F2表型分析两种油蚕的遗传关系。

ojc与pe杂交,F2代单蛾区分白卵与黑卵单独收蚁饲养,调查蛾区内分离情况,确定ojc与pe是否连锁,同时配制ojc与pe的双隐性材料;ojc与wb杂交,配制二者的双隐性材料;在两个双隐性材料基础上进行杂交,同样方法获得pe、wb、ojc的三隐性系。具体流程参照代方银等[10](2007)发表论文中图1、2所示方案。

同时进行ojc与ok致死率调查,初步了解二者在基因作用上的异同。

2 结果与分析

2.1 ojc油蚕与pe的连锁分析

赵巧玲等用re对ojc进行了连锁分析,本次实验又选择了第5连锁群的桃红眼白卵(pe)对ojc所属连锁群进行了再次验证。用pe与ojc杂交,F2代单蛾区分白卵和黑卵饲养,壮蚕期调查油蚕和正常蚕的分离比,结果饲养的3个蛾区中白卵部分都没有发现油蚕。由于家蚕雌完全连锁,在ojc和pe连锁的情况下,在杂交F2代中不会出现既是pe白卵又是ojc油蚕的个体,而是按照黑卵正常蚕∶黑卵油蚕∶白卵正常蚕=2∶1∶1的模式分离,本实验结果与之相符(3龄调查结果见表1);如果ojc和pe是独立遗传关系,则杂交F2应出现黑卵正常蚕∶黑卵油蚕∶白卵正常蚕∶白卵油蚕=9∶3∶3∶1,结果不然。据此我们判断ojc与pe连锁。这一结果与之前的报道[3]一致。

表1 (ojc×pe)F2性状分离

2.2 jc油蚕与ok油蚕的杂交结果

家蚕第5连锁群上的油蚕基因有oc、ok和otm。赵巧玲等[3]对oc与ojc的杂交试验已确定这两个基因位于不同的基因座上;otm为斑油蚕,而且透明度低,与jc油蚕的性状相差甚远。而ok油蚕与ojc同样为高度油蚕,但是二者间没有经过遗传实验鉴定。2009年我们对ok和ojc进行了正反杂交试验,结果杂交F1代全部为油蚕,油蚕性与亲本一致,F2代亦没有出现性状分离,表型与亲本和F1代一致,这一结果说明ok和ojc是同一基因座的突变。

2.3 jc油蚕与ok油蚕致死性调查结果

分别单蛾区饲养jc油蚕与ok油蚕各10蛾,同时饲养正常型蚕品种大造作为对照。各龄期死亡情况在饷食后第2d调查,蚁蚕头数通过对孵化后的卵壳计数得到。调查发现各龄期大都在眠期出现死蚕,其中jc油蚕1龄眠中平均死亡率9.41%,其它龄期极少出现死蚕(表2);ok油蚕1龄眠中平均死亡率15.04%,2眠和3眠极少死蚕,4眠时平均死亡率高于jc油蚕,为9.61%(表3)。大造对照区1眠中死亡率2.22%(只调查了1蛾区蚕卵的幼虫),其它龄期均没有死蚕,可能仅是由于收蚁过程中损伤蚁蚕导致的死亡。

表2 jc油蚕幼虫各龄期死亡率调查

表3 ok油蚕幼虫各龄期死亡率调查

2.4 jc油蚕与pe、wb的三隐性系的培育

在进行ojc油蚕与pe连锁验证的同时,我们还选择了家蚕第5连锁群的wb突变开展了ojc油蚕与pe以及wb三隐性系的培育工作。从分白卵和黑卵饲养的pe和ojc杂交F2代中,黑卵部分选留油蚕个体与白卵部分杂交,从白卵部分选择油蚕个体自交保种,便可得到pe-ojc双隐性系。pe-wb双隐性系的培育方法与此同。在作成了pe-ojc和pe-wb两个双隐性系统之后,因两系统中pe已经纯合,我们再将这两个材料杂交,用同样的方法育成ojc和wb两个基因的双隐性系统,便育成了pe、wb、ojc的三隐性系。

利用家蚕雌完全连锁规律,两个基因间杂交F2代的基因型只有8种,以pe、ojc为例,其中表现白卵性状的有pe+/pe+和pe+/pe ojc两种基因型;表现油蚕性状的有+ojc/+ojc和pe ojc+/ojc两种基因型,而只有pe+/peojc和pe ojc/+ojc两种基因型的个体自交或者测交,才会出现既是白卵又是油蚕(pe pe/ojcojc)的后代,但这两种基因型是由交换型配子组成的,因此这两种基因型的个体较少,所以要适当放大饲养群体才有可能得到peojc/peojc的双隐性纯合体。

3 小结与讨论

通过对jc油蚕进行连锁群验证、与ok油蚕进行杂交,结果表明jc油蚕与ok基因处于同一个基因座位。jc油蚕幼虫皮肤透明度与ok油蚕皮肤透明度相当,为高度油蚕。两种油蚕幼虫都具有一定致死性,且主要是眠中死亡,较之ok油蚕,jc油蚕幼虫致死率低一些。

家蚕突变基因的发掘和研究是重要的基础工作。而新突变基因的鉴定和定位需要丰富的遗传突变资源和定位标记体系作支撑。不同研究者对遗传材料的辨认亦存在差异。ok油蚕为高度油蚕[2],本试验中两种油蚕相比油蚕性接近,皮肤透明度均高,因此,本研究认为jc油蚕亦为高度油蚕。本试验jc油蚕的致死率较之前报[3]的数据低,分析其原因可能是两次实验使用的资源系统遗传背景存在差别,以及环境因素导致的死亡率不同。本研究调查的材料是经过与大造杂交后的油蚕纯合系,遗传背景与前报实验材料不同。

根据本实验结果,jc油蚕与ok油蚕的杂交没有性状分离,而初步调查结果显示在幼虫致死率上存在一定差异,初步判断为等位点突变,故将ojc基因符号修改为okc,基因座5-4.7。所培育的三隐性材料也记为pe-wb-okc。但就现有的研究结果,还不能完全排除jc油蚕与ok为重复突变的可能,有待通过分子水平上的研究最终作出判定。

[1]向仲怀主编.家蚕遗传育种学[M].北京:农业出版社,1994:24-31.

[2]向仲怀主编.蚕丝生物学[M].北京:中国林业出版社,2005:375-394.

[3]赵巧玲,叶夏裕,夏定国,等.家蚕Jc油蚕基因的发现和连锁分析[J].蚕业科学,1997,32(4):211-214.

[4]代方银,鲁成,向仲怀.家蚕基因资源品系油蚕突变体的鉴定试验[J].蚕学通讯,1997,17(2):2-6.

[5]代方银,鲁成,夏庆友,等.家蚕新突变型h斑油蚕基因的连锁定位研究[J].蚕业科学,2002,28(1):22-25.

[6]代方银,鲁成,宗俊英,等.家蚕新突变型第二h斑油蚕的遗传分析[J].蚕学通讯,2001,21(4):1-3.

[7]代方银,鲁成,丁会勇,等.地方蚕品种柘蚕油蚕性的遗传学研究[J].蚕学通讯,2002,22(1):14-16.

[8]孟智启,伴野丰,土井良宏.新油蚕基因of的发现[J].蚕业科学,1996,22(2):117-118.

[9]秦俭.家蚕oe油蚕的遗传学研究[J].蚕业科学,1987,13(3):183-185.

[10]代方银,谭端,童晓玲,等.含有母性影响遗传基因的连锁定位系的构建[J].遗传,2007,29(11):1393-1398.