糖皮质激素受体在大鼠重症胰腺炎中的表达变化及甲强龙冲击治疗后的影响

李树生,熊建平,曾永明,王维刚,陈少锋

(汕头市潮南民生医院普外科,广东 汕头 515144)

重症急性胰腺炎(SAP)是一种严重的分解代谢疾病,常由于剧烈的全身炎症反应和全身性感染引起多器官功能障碍(MODS),病死率较高(10%-20%)[1]。研究表明,在创伤、失血、感染等应激情况下,糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)分泌增多是应激的一个最重要的反应,对机体抵抗有害刺激起着极为重要的作用。GC的效应不仅取决于其在血浆中的浓度,而且还取决于靶细胞上糖皮质激素受体(Glucocorti-coidreceptor,GR)的数量和亲和力[2]。动物实验发现应激时可发生 GR的数量和亲和力下降,而 GR又是体内重要的炎症负调控因子[3],本试验研究早期大剂量甲基强的松龙冲击治疗大鼠重症胰腺炎,为糖皮质激素治疗胰腺炎提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及动物 SPF级雄性 SD大鼠72只,体重(300±50)g,由广州中医药大学实验动物中心提供;L-精氨酸由上海生物工程有限公司提供;戊巴比妥钠由广州南方化玻璃公司提供;淀粉酶检测试剂盒,美国 Begman公司生产;兔抗大鼠 GR多克隆 IgG抗体(Santa Cruz公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及动物模型的制作 2009年6月至 2009年 10将 72只 SD大鼠随机分成三组(每组 24只,每组又分 6 h、12 h、24 h三个时间点):正常对照组(NS组);重症胰腺炎生理盐水治疗组(SAP组);重症胰腺炎甲强龙治疗组(MES组)。各组术前 12 h禁食,不禁水。动物 SAP模型是通过腹腔内注射 L-精氨酸(320 mg/100 g),L-精氨酸用生理盐水配置成 20%浓度,第一次注射后间隔 1 h再次以相同计量腹腔内注射一次[4]。NS组将 L-精氨酸换成等量的生理盐水,方法同 SAP、MES两组。模型制作前 10 min通过尾静脉注射药物,MES组为甲基强的松龙(30 mg/kg),加入 1 ml的生理盐水尾静脉注射;SAP组为等量生理盐水。三组分别在注射药物后 6 h、12 h、24 h、72 h通过腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后剖杀大鼠取标本进行相关指标检测。

1.2.2 实验标本的采集 模型制作成功,注射药物后分别于 6 h、12 h、24 h通过腹腔内注射 2%戊巴比妥钠麻醉后心脏取血 2份,每份约 2 ml,等血液凝固,血清析出后,离心分离(3 000 r/min,10 min),放置在 -70℃冰箱冻存,用于血清淀粉酶的检测。切取胰腺组织,一分为二,其中一半用于湿干比的检测,另一半再分成两份,一份用于 GR检测,另一份用 4%多聚甲醛固定,石蜡包埋后用于胰腺病理学观察。

1.2.3 检测指标及方法

1.2.3.1 各组大鼠 -70℃保存的血清于贝克曼 CX9全自动生化仪上检测血清淀粉酶。

1.2.3.2 湿干比率的检测。各组大鼠处死后,切取一半胰腺组织在电子天平上称重,为湿重量;再将切取的胰腺组织于 60℃烘干 24 h,至质量不变,计算湿干比率。

1.2.3.3 采用单盲法,由病理科医生在光镜下观察胰腺组织病理学改变。胰腺组织按照 Schmidt镜下病理评分标准进行评分[5]:各时点随机选取 5只大鼠的胰腺病理切片,对每只大鼠病理切片进行单独评分,5只大鼠的平均分数为各时点大鼠胰腺的最后病理评分。

1.2.3.4 蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)检测胰腺组织内 GR水平。新鲜组织 100 mg,与冰预冷的 0.01 mol/LPBS充分洗涤后加入适量RIPA蛋白提取液匀浆后冰上裂解 30 min,适时振荡,4℃离心弃去沉淀取上清。行 10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(恒压 100 V,15 h)。待电泳完毕后转印 2 h至 PVDF膜,按蛋白 Maker将膜分为 GR(94 kD)和内参(43 kD)两张,室温下 5%脱脂牛奶中封闭 2 h:(1)含有 GR蛋白条带的膜加入兔抗大鼠 GR多克隆 IgG一抗(1∶200稀释),4℃过夜后放入二抗为羊抗兔 IgG(1∶500稀释)室温反应 2 h;(2)含有内参蛋白条带的膜放入内参抗体(1∶3 000)室温 2 h后分别增强化学发光法显色,X线底片曝光显影。以显影条带的灰度值与内参条带的灰度值的比值表示 GR蛋白表达水平。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 13.0进行单因数方差分析和 LSD法两两比较。全部数据以均数 ±标准差(x±s)表示,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清淀粉酶 SAP组较 NS组在 6 h、12 h、24 h的血清淀粉酶值明显升高(P＜0.01),MES组较 SAP组在 6 h、12 h、24 h的血清淀粉酶值明显降低(P＜0.01),详见表 1。

表1 各组血清淀粉酶活性测定结果(x±s,U/L)

2.2 胰腺组织湿干比重 SAP组较 NS组在 6 h、12 h、24 h的胰腺湿干比率明显升高(P＜0.01),MES组较 SAP组在 6 h、12 h、24 h的胰腺湿干比率明显降低(P＜0.05),见表 2。

表2 各组大鼠胰腺组织湿干比重结果(x±s)

2.3 胰腺组织病理学改变及评分 SAP组较NS组在 6 h、12 h、24 h的病理学评分明显升高,MES组较 SAP组在 6 h、12 h、24 h的病理学评分明显降低(P＜0.01),见表 3。

表3 各组大鼠不同时相胰腺组织病理学评分结果(x±s,分)

2.4 胰腺组织内 GR受体变化 SAP组较 NS组在 6 h、12 h、24 h的 GR蛋白表达明显降低,MES组较 SAP在 6 h、12 h、24 h的 SAP组在 6 h、12 h、24 h的 GR蛋白表达明显升高(P＜0.01),见表 4。

表4 各组大鼠胰腺组织内 GR蛋白表达变化(x±s)

3 讨 论

急性胰腺炎时多种酶和生物活性物质的释放,使得白细胞过度激活,引起炎症介质的瀑布样连锁反应。正是由于多种炎症介质的共同作用,导致急性胰腺炎从局部病变迅速发展为 SAP这一全身性病变,在胰腺组织大量坏死的同时,并发全身多个脏器功能障碍[6]。本实验我们通过建立了 SAP大鼠模型,观察到大鼠 SAP早期血清淀粉酶,胰腺湿干比率出现明显升高,胰腺出现病理损伤,且随着时间的延长,炎症反应及胰腺病理损伤明显加重。

甲基强的松龙属于糖皮质激素类(GC),可以抑制多种炎症介质的基因合成,并可通过增加抗炎蛋白的合成发挥抑制炎症介质的作用,从而达到减轻 SIRS程度,提高 SAP大鼠的生存率。GC是通过广泛分布的细胞内特异性糖皮质激素受体(GCR)行使其主要功能,GC-GCR复合物是体内重要的抗炎因子。多种危重病发生发展中,由于 GCR蛋白合成减少,应激反应中内源性 GC的升高及 GCR分解的加速等原因,均出现 GCR的减少[7]。GCR无备用受体,当GCR减少超过 50%时,GC-GCR复合物效应也平行地降低。尽管应激反应时内源性 GC分泌过多,但由于 GCR的显著减少或由于炎症反应时高细胞因子导致的 GCR抵抗[8],对机体不足以发挥正常的 GC-GCR作用。此时就必须加大 GC的用量以结合 GCR的全部,使 GCR的作用得到最大程度的利用,充分发挥 GC-GCR的抗炎作用。研究表明,在 SAP中,机体在应激时大量炎性介质产生可以影响激素受体的表达和功能,诱导转录活化蛋白 1和核因子 -κB(NF-κB)的过度表达,导致皮质激素受体抵抗(Corticosteroid receptor resistance,CRR),使糖皮质激素利用障碍[9]。GC是维系生命的重要活性介质和机体应激反应的基本组成部分,具有维持循环功能稳定的作用。因此,维持正常的 GR数量与功能在各种严重应激性疾病的治疗中发挥着重要作用。在本实验中,我们通过腹腔内注射 L-精氨酸建立大鼠 SAP模型,结果可以看出在重症胰腺炎的早期就出现糖皮质激素受体减少,并且随着炎症反应的加剧,其下降程度进一步恶化。早期、大剂量的使用甲基强的松龙冲击治疗后,糖皮质激素受体水平明显提高;同时也能有效地降低血清淀粉酶、胰腺水肿及胰腺病理损伤。但是,大剂量甲基强的松龙提高糖皮质激素受体水平的机制,本实验尚未能阐明,我们推测,大剂量的甲基强的松龙冲击治疗后,能有效地减轻糖皮质激素受体抵抗作用,恢复其正常时的浓度,但确切的机制有待于今后进一步的实验研究阐明。

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