难治性癫痫多药转运体及动物模型的研究△

蒋 颖综述 韦云飞 秦 超审校

(广西医科大学第一附属医院神经内科,南宁市 530021)

癫痫是神经系统的常见病、多发病,为不同病因引起的一组脑功能障碍性疾病和综合征,他以脑部神经元异常过度放电所致的突发和短暂的中枢神经系统失常为特征,常常反复发作。癫痫药物为癫痫患者带来了福音,由于受病理特性、抗癫痫药物使用不当等因素的影响,目前,仍有 20%～40%患者发展成为难治性癫痫[1]。目前,难治性癫痫(IE)的定义为:3～4年以上的癫痫病程;每月至少有 4次以上的癫痫发作;经过长期系统的多种抗癫痫药治疗,即使在血药浓度检测下也不能控制癫痫发作,且因癫痫发作频繁,严重致残,影响学习、工作和生活者。

1 多药转运体

近年的研究认为,IE的发生与脑内多药转运体表达增多导致多种抗癫痫药物在脑组织内浓度降低有关。目前多药转运体抗癫痫药物耐药机制研究的热点有多药耐药基因(MDR)、多药耐药相关蛋白(MRP)、穹窿主蛋白(MVP)等。

1.1 MDR MDR是第一个被发现的与难治性癫痫有关的耐药基因。人类的 MDR位于染色体的第 7号长臂,有 28个外显子,可以转录 4.5kb的 mRNA。人类 MDR基因由 MDR 1和MDR 2组成,MDR 1起主要作用,编码一种相对分子质量为170×103的细胞膜所固有的一类跨膜磷脂糖蛋白,即 P-糖蛋白(Pgp)。Pgp的整个分子有 2个几乎相等的半部由链区连接,每个半部含 6个疏水跨膜区及一个短的亲水氨基酸末端,有 2个 ATP结合位点,在 ATP供能的前提下通过主动转运的方式将亲脂性药物泵出细胞外,具有 ATP依赖性药泵的作用[2]。Pgp的生理功能主要是降低细胞内、外毒物的积累量,或改变药物在胞内的亚细胞分布而保护机体,构成机体重要的生理防线以抵抗外来药物及毒物。生理条件下,Pgp广泛表达于在与排泄有关的组织器官中,如肝脏、肾脏、小肠及血 -组织屏障,如血脑屏障及血胎盘屏障,在脑组织的神经胶质及神经元中无表达。相关难治性癫痫的研究表明,神经系统异常表达的 Pgp广泛分布在脑实质星型胶质细胞、脑毛细血管内皮细胞上。

在临床研究中,丁成云等[3]应用免疫组化和免疫组化双标记技术研究发现,IE患者脑组织中MDR 1蛋白的表达主要在一些增生性星形胶质细胞和毛细血管壁周围结构,而寡突胶质细胞、小胶质细胞及正常的神经元内无MDR 1蛋白的表达;增生性星形胶质细胞内 MDR蛋白与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)具有共存现象。Tisher等[2]用免疫组化和定量转录酶PCR分析 19例手术切除的 IE患者脑组织中 MDR 1表达和Pgp的变化,同时测定细胞内 PHT的浓度,结果发现有 11例患者MDR mRNA水平超出正常的 10倍,14例患者 Pgp在毛细血管内皮中染色较正常脑组织增强;Domobrowski等[4]用 cDNA基因扩增检测技术研究 IE患者颞叶内皮细胞,发现 MDR呈过度表达且Pgp水平显著高于对照组。郑学平等[5]采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测外周血中 MDR 1基因mRNA的表达,结果显示难治性癫痫患者(全面性强直一阵挛发作癫痫、部分性发作癫痫、失神发作癫痫)外周血中MDR 1基因mRNA的表达。

在动物模型的研究中,肖争等[6]用苯妥英钠和苯巴比妥筛选单侧杏仁核点燃大鼠模型,6周后免疫组化检测耐药组和有效组大鼠脑组织MDR 1的表达产物Pgp,显示杏仁核、颞叶、额叶、顶叶等除小脑外的脑区,耐药组Pgp的表达均显著高于有效组,且耐药组星型胶质细胞的Pgp表达更显著;Rizzi等[7]用RT-PCR检测海人酸点燃大鼠MDR 1基因mRNA及Pgp表达,在海马和内嗅皮质分别提高 1.8倍和 5倍。Volk等[8]通过制作杏仁核电点燃癫痫大鼠模型,在完全点燃 8 h大鼠脑组织免疫组化结果显示,IE模型鼠边缘系统包括海马神经元Pgp的表达比非耐药组显著增多。

1.2 MRP MRP是一个新发现的多基因家族,目前研究共发现 MRP多基因家族 7个基因:MRP1～MRP7,其中 MRP1与 IE的耐药关系最密切。MRP1是一种与 ATP结合的相对分子量为 190×103的磷酸化糖蛋白,由 1 531个氨基酸组成。MRP含 3个反复穿膜的疏水跨膜区和 2个核苷酸结合功能区,其中含 2个ATP结合位点,通过水解 ATP供能主动转运相应的底物。生理条件下,MRP主要表达在肺、肝细胞和肠上皮细胞、肾小管、睾丸等正常组织的细胞质中,异常表达的MRP主要过度表达在细胞膜上[9,10]。MRP与 Pgp一样通过主动转运逆浓度梯度将疏水化合物泵出细胞,药物外排增加,药物在细胞内的亚细胞分布降低,导致耐药性的产生。

在临床研究中,Kubota等[11]发现由海马硬化引起的 IE患者海马及齿状回的实质细胞和内皮细胞上 Pgp呈过度表达,MRP1表达在齿状回实质细胞,MRP2表达在海马内皮细胞,并用 RT-PCR技术检测发现 IE患者 MDR1、MRP1、MRP5、MRP6的mRNA水平较正常对照组显著增高。Lazarowski等[12]应用免疫组化及单克隆抗体技术研究结节性硬化患者脑组织,发现在气球样细胞、发育不良的神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等上均有 MDR 1、MRP1的高表达。

在动物模型的研究中,vanVliet等[13]研究电刺激慢性癫痫大鼠模型中发现,癫痫持续状态后,Pgp、MRP1、MRP2过度表达在边缘结构内星形胶质细胞上,尤其在血管和血管周围的星形胶质细胞。Hoffmann等[14]研究 MRP基因敲除的小鼠,发现小鼠脑组织中苯巴比妥浓度明显高于野生型小鼠。

1.3 MVP 近年来,一种 1993年最初从非小细胞肺癌中发现的多药耐药蛋白,即MVP也成为难治性癫痫研究的热点,MVP在肿瘤耐药中的主要作用机制表现为将药物从细胞内的特定靶点中转出,其是否会以相同方式参与到难治性癫痫的发病机制中引起大家的关注。Aronica等[15]2003年对 30例经外科手术治疗的由神经节细胞胶质瘤引发难治性癫痫的患者进行研究,发现在全部 30例脑组织标本中均可检测到 MVP的表达程度较对照组有明显升高。Sisodiya等[16]在对难治性癫痫患者进行研究时也发现,在海马硬化、局灶性皮质发育不良以及胚胎发育不良性神经上皮肿瘤的异常神经元中MVP存在过度表达。但 MVP的相关研究较少,MVP在难治性癫痫中的作用机制至今仍不明确,有待进一步研究发现。

2 难治性癫痫的动物模型

由于癫痫患者脑组织取材困难,即使获取标本,在离体脑组织上模拟发作的真实情况也极为不易,而在患者身上研究IE的发生机制也比较困难,因而考虑建立 IE模型,利用 IE模型探讨其形成和耐药机制以及筛选新的抗癫痫药物。难治性癫痫动物模型建立的国际标准[17]:①一线的抗癫痫药物不能控制其癫痫发作;②模型发作时有脑部异常放电,可从电生理角度评价药物疗效;③发作类型应与临床类型相似,即复杂部分性发作继发全身性发作 ;④能够长期存活,可进行抗癫痫药物的长期研究。

2.1 遗传性癫痫动物模型 遗传性癫痫动物痫性发作在癫痫行为、电生理和生化改变上与人类接近。研究发现,有的动物本身具有癫痫先天易感性[17],其中,有先天性声源性敏感小鼠、光敏性雏鸡、光敏感狒狒等,其反射性、易感性在人类少见,不适合制作 IE模型。有的可以通过基因打靶制成的转基因癫痫模型,或是通过理化和放射线使其皮层发育畸形而对癫痫易感,但转基因模型制作复杂,价格昂贵,且植入基因在不同载体基因背景下表型不同,与皮层畸形模型一样不易出现自发性癫痫发作,国内目前较少用于IE模型的研究。遗传性癫痫狗部分性发作类似于人类难治性癫痫表现,但因胃肠蠕动快和绝大多数 AED在狗体内被迅速代谢,研究所需时间内无法保持有效的血药浓度。小鼠为遗传性局灶性发作的模型,但其发作频率不规范,不适合用于IE的研究。遗传性癫痫易感大鼠对部分传统抗癫痫药有效,不适合作 IE的动物模型研究。

2.2 点燃模型 目前,应用最广泛的癫痫模型为点燃模型,其发病机制被认为与人类癫痫的发病机制相似。根据刺激方法,点燃模型主要有电点燃和化学点燃。点燃不仅可进行性提高发作敏感性,还可以引起脑功能改变,是现在公认的难治性癫痫的理想模型。

2.2.1 电点燃模型 电点燃是以同等强度的阈下刺激,在一定的时间间隔下重复刺激动物边缘脑区的某一部位,使癫痫活性强度逐渐增加,最终出现全面性癫痫发作。最常见的电点燃部位有杏仁核,其次是新皮质区和海马[18]。由于,对电刺激最敏感,目前用于难治性癫痫研究的主要有杏仁核点燃模型。电点燃杏仁核引起的自发性边缘系统癫痫与人类颞叶癫痫在症状学、神经病理学和行为学缺陷等方面均很相似,并且模型稳定性好,致痫效应相对持久,点燃状态一旦形成可以持续至少数月,继续刺激还可形成自发性癫痫,重复诱发率高,发作行为可控性好,诱发需要的刺激次数、行为级数、后放电阈值、后放电时程等均可作为定量研究的依据,是一种较理想的IE动物模型。但缺点主要是制作复杂、动物不易饲养、容易死亡等。

2.2.2 化学点燃模型 化学点燃是反复给予低于抽搐剂量的药物诱发逐渐加重的癫痫发作,用在脑内或全身性注射进行点燃的有海人酸(kainic acid,KA)、青霉素、戊四氮、美解眠、匹鲁卡品等。青霉素点燃可用于诱发全面性癫痫发作和失神发作的模型;戊四氮和美解眠可诱发急性全身性发作的模型,但易于被AED控制,不适合制作难治性癫痫模型;匹鲁卡品可诱发复杂部分发作继发全身性发作的模型。现在应用最广泛的化学点燃模型有 KA,KA点燃的复杂部分发作模型是一种较理想的难治性癫痫动物模型,可局部脑室、海马、杏仁核给药或全身给药,KA模型制作比较简单,发作时与人类颞叶癫痫的行为特点相似,神经病理学研究上发现模型的神经元丢失、胶质细胞增生、苔藓纤维丝状芽生等与人类颞叶癫痫相似,KA模型对大部分抗癫痫药物耐药,已广泛应用于难治性癫痫耐药机制的研究中,但 KA模型对癫痫灶的控制及预测癫痫发作较电刺激模型差,在难治性癫痫研究中有一定限制。

3 展 望

目前,对于难治性癫痫的研究多局限在针对手术切除的脑组织及动物模型的癫痫脑组织上,一定程度上限制了临床实践,因此寻求客观的外周指标,有利于协助难治性癫痫在临床中的诊治[19,20]。而理想的模拟人类各种类型癫痫发作的动物模型,为今后的临床研究打下坚实的研究基础。在现有研究基础上,有望较早的发现难治性癫痫患者,应用逆转录药物,提高难治性癫痫的治疗成功率,给患者带来福音。

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