构树皮中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分

鲍 玲,崔文峰,郁建平,喻凯,王明奎＊

1中国科学院成都生物研究所中国科学院山地生态恢复与生物资源利用重点实验室,生态恢复与生物多样性保育四川省重点实验室,成都 610041;2贵州大学生命科学学院,贵阳 550025;3西南交通大学生物工程学院,成都 610031

构树皮中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分

鲍 玲1,崔文峰2,郁建平2,喻凯3,王明奎1＊

1中国科学院成都生物研究所中国科学院山地生态恢复与生物资源利用重点实验室,生态恢复与生物多样性保育四川省重点实验室,成都 610041;2贵州大学生命科学学院,贵阳 550025;3西南交通大学生物工程学院,成都 610031

本文报道构树皮中α-葡萄糖苷酶抑制剂的分离鉴定。构树皮的乙醇浸膏通过溶剂萃取以及各种柱层析方法分离纯化得到 6个化合物,通过波谱学方法鉴定为:broussonetine A(1),broussonetinine A(2),broussonetinine B(3),黑立脂素苷 (liriodendrin)(4),butyrospermyl acetate(5)以及胡萝卜苷 (6)。所有化合物均首次从构树中分离得到,其中 1～3具有较强抑制α-葡萄糖苷酶的活性,IC50有分别为 0.530、0.445和 0.460 mg/ mL。

构树;broussonetine A;broussonetinine A;broussonetinine B;α-葡萄糖苷酶抑制剂

构树 (B roussonetia papyrifera(L.)Vent)为桑科构属直立落叶乔木,广泛分布于全国各地。构属植物全世界共有四种,中国产三种,其中两种可作药用[1]。构树的果实、树叶、枝条、茎皮部乳汁和根皮均可入药,具有补肾清肝,明目利尿、健胃、消炎、凉血止血之功效,用于腰膝酸软,虚劳骨蒸,头晕目昏,目生翳膜,水肿胀满。现代药理研究表明其具有很好的抗真菌作用。国外学者从小构树 (B.kazinoki Sieb)中还分离得到很多对α-葡萄糖苷酶有较好抑制作用的多羟基生物碱[2-10],对构树根皮也进行过研究,从中分离出大量的黄酮和二苯丙烷类化合物,但还没有关于生物碱类成分的报道[11]。

我们用自己建立的α-葡萄糖苷酶模型[12]在筛选糖苷酶抑制成分的过程中,发现构树的提取物有较好的抑制活性。因此,我们对构树皮的成分进行了分离鉴定,并进行了活性测试。从构树干燥树皮的乙醇提取物中分离得到 6个化合物,经波谱方法鉴定为:broussonetine A(1)、broussonetinine A(2)、broussonetinine B(3)、黑立脂素苷 (liriodendrin,4)、butyrospermyl acetate(5)和胡萝卜苷(6)。其中化合物 1～3在体外有较强的抑制α-葡萄糖苷酶的作用。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Avance Bruker 600兆核磁共振波谱仪;LCQ型质谱仪 (美国 Ther mo-Finnigan公司,配置有 ESI离子源和直接进样注射泵,离子阱质量分析器);D72大孔树脂 (南开大学树脂厂);RP-C18材料 (日本和光纯药公司);硅胶 GF254(青岛海浪硅胶干燥剂厂);氧化铝(上海新诚化工有限公司)。

构树 (B roussonetia papyrifera(L.)Vent)皮样品于 2006年 5月采自重庆市开县巫山乡,由中国科学院成都生物研究所包维楷研究员鉴定。标本保存在成都生物研究所标本室。

1.2 提取分离

干燥构树皮 16 kg粉碎后,用 95%乙醇冷浸 4次,每次 7 d,合并提取液,减压浓缩得油状浸膏 1.3 kg。浸膏冷却后析出浅黄色固体 1.4 g。其余浸膏用 2000 mL蒸馏水超声分散,1000 mL氯仿反复萃取4次,水相稀释到5000 mL后,通过D72大孔树脂柱(30×5 cm)。用 10 L水,2.5 L乙醇,3 L 5%的氨-乙醇溶液依次洗脱,氨-乙醇洗脱液浓缩,得到固体物 7.7 g。取 3.6 g样品进行氧化铝 (100～200目)柱层析(氯仿-甲醇 =15∶1～1∶1梯度洗脱),硅胶(200～300目)柱层析(氯仿-甲醇 =10∶1～1∶1梯度洗脱)和 C18反相柱层析 (10%～40%甲醇水溶液梯度洗脱),得到化合物 1(316 mg)、2(314 mg)、3 (50 mg)和 4(48 mg)。取 0.9 g浸膏中析出的固体,甲醇溶解后拌入 1.2 g硅胶,用 200～300目硅胶经柱层析(石油醚-乙酸乙酯 =20∶1梯度洗脱)得化合物 5(418 mg)。氯仿萃取物减压浓缩蒸干, 1000 mL甲醇溶解,500 mL石油醚反复萃取 4次,甲醇层 36.2 g拌样上硅胶柱 (石油醚-乙酸乙酯 =1∶2～1∶4梯度洗脱)分离得到一个固体,用甲醇结晶,得到化合物 6(566 mg)。

2 鉴定

化合物 1 白色粉末,mp.154～156℃,茚三酮显黄色,ESI-MSm/z508[M+H]+,1H NMR(pyridine-d5,600 MHz)δ:3.78(1H,m,H-2),4.83(1H, t,J=4 Hz,H-3),4.10(1H,m,H-4),3.73(1H,m, H-5),2.00(2H,m,H-1′),1.10-1.59(12H,m,H2′-H7′),1.60(2H,m,H-8′),2.49(2H,t,J=7.6 Hz, H-9′),2.76(2H,t,J=7.6 Hz,H-11′),2.16(2H, quintet,J=7.5 Hz,H-12′),3.96(2H,t,J=6.3 Hz, H-13′),4.30(2H,m,CH2OH),5.08(1H,d,J= 7.8Hz,H-1′′),4.10(1H,m,H-2′′),4.40(1H,m,H-3′′),4.15(1H,m,H-4′′),4.44(1H,m,H-5′′),4.60 (2H,m,H-6′′);13C NMR(pyridine-d5,150 MHz)δ: 61.5(C-2),73.3(C-3),88.9(C-4),59.8(C-5), 35.4(C-1′),29.5(C-2′),29.5(C-3′),29.6(C-4′), 29.7(C-5′),29.9(C-6′),27.4(C-7′),24.0(C-8′), 42.6(C-9′),210.7(C-10′),39.3(C-11′),27.6(C-12′),61.1(C-13′),62.3(CH2OH),105.3(C-1′′), 74.7(C-2′′),78.1(C-3′′),71.2(C-4′′),78.3(C-5′′),62.3(C-6′′),以上数据与文献[4]报道数据一致,故鉴定为 broussonetine A。

化合物 2 白色粉末,茚三酮显黄色,ESI-MS m/z346([M+H]+),1H NMR (pyridine-d5,600 MHz)δ:3.83(1H,m,H-2),4.67(1H,br.s,H-3), 4.18(1H,m,H-4),3.64(1H,m,H-5),1.85,1.62 (2H,m,H-1′),1.08～1.58(12H,m,H-2′～H-7′), 1.56(2H,m,H-8′),2.37(2H,t,J=7.5 Hz,H-9′), 2.63(2H,t,J=7.2Hz,H-11′),2.03(2H,quintet,J =7.5 Hz,H-12′),3.92(2H,br.s,H-13′),4.27, 4.22(2H,br,CH2OH)。氢谱数据与文献[4]报道数据一致,故鉴定为 broussonetinine A。

化合物 3 白色粉末,茚三酮显黄色,ESI-MS m/z346([M+H]+),1H NMR (pyridine-d5,600 MHz)δ:3.85(1H,m,H-2),4.67(1H,br.s,H-3), 4.20(1H,m,H-4),3.56(1H,m,H-5),1.85,1.62 (2H,m,H-1′),1.08～1.58(12H,m,H-2′～H-6′), 1.56(2H,m,H-7′),2.31(2H,t,J=7.5 Hz,H-8′), 2.43(2H,t,J=7.2 Hz,H-10′),1.84(2H,quintet,J =7.5 Hz,H-11′),1.70(2H,quintet,J=7.5 Hz,H-12′),3.92(2H,br.s,H-13′),4.42(2H,br, CH2OH)。氢谱数据与文献[4]报道数据一致,故鉴定为 broussonetinine B。

化合物 4 无色针晶 (吡啶),mp.265～266℃。UV(H2O)nm:272,226;I R(KBr)cm-1:3400 (OH),1600,1505;由氢谱、碳谱和质谱推测该化合物为具有对称结构的糖苷。1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ6.66处出现 1个单峰,为苯环上的 4个芳香氢信号,4.66(2H,d,J=3.8 Hz,H-2,6),4.21 (2H,m,H-4,8),3.83(2H,m,H-4,8),3.14(2H, m,H-1,5),3.76处出现的单峰为苯环上的甲基氢信号,此外,δ4.87处出现的氢信号为葡萄糖上的端基氢,δ3.09～3.62处出现一系列多重峰,归属为葡萄糖上的其他氢信号。13C NMR(DMSO-d6,150 MHz)δ:152.6(C-3′),137.1(C-4′),133.8(C-1′),104.3(C-2′),102.7(C-1′′),85.0(C-2,6), 77.1(C-5′′),76.5(C-3′′),74.1(C-2′′),71.3(C-4,8),69.9(C-4′′),60.9(C-6′′),56.4(OCH3), 53.5(C-1,5);ESI-MSm/z:765[M+Na]+,603 [M– glc+Na]+,441[M– glc– glc+Na]+。以上数据与文献[13]报道一致,故鉴定为黑立脂素苷(liriodendrin)。

化合物 5 白色针晶 (乙酸乙酯),C32H52O2, mp.136～138℃。 IR (KBr)cm-1(max):2932 (OH),1741(C=O),1460,1362;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ:5.25(1H,d,J=2.9 Hz,H-7),5.10 (1H,brt,J=7.0 Hz,H-24),4.52(1H,dd,J= 10.5,4.4 Hz,H-3),0.97(3H,s,H-30),0.93(3H, s,H-29),0.85(3H,d,J=5.6 Hz,H-21),0.85 (3H,s,H-28),0.80(1H,s,H-18),0.77(1H,s,H-19);13C NMR(CDCl3,150 MHz)δ:171.0(C=O), 146.0(C-8),130.9(C-25),125.1(C-24),117.6 (C-7),81.1(C-3),53.2(C-17),51.3(C-14), 50.8(C-5),48.8(C-9),43.5(C-13),37.8(C-4), 36.8(C-1),35.8(C-20),35.2(C-22),34.8(C-10),33.9(C-15),33.8(C-12),28.4(C-16),27.6 (C-28),27.3(C-30),25.7(C-26),25.3(C-23), 24.2 (C-2),23.8 (C-6),22.0 (C-18),21.3 (COCH3),18.6(C-21),18.1(C-11),17.7(C-17),15.9(C-29),13.1(C-19)。以上数据与文献[14]报道一致,故化合物 5被鉴定为 butyrospermyl acetate。

化合物 6 白色粉末(甲醇),mp.285～287℃。Liebermann-Burchard反应阳性,Molish反应阳性,香草醛-浓硫酸显紫红色。与胡萝卜苷标准品 TLC的Rf值一致。故化合物 6被鉴定为胡萝卜苷 (daucosterol)。

多羟基生物碱类化合物是一类具有显著抑制葡萄糖苷酶活性的化合物[15]。对本次研究中所分离得到的化合物 1～6进行了体外α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选,采用经典的大鼠小肠外翻囊蔗糖吸收抑制试验,发现化合物 1～3在体外有较强的抑制α-葡萄糖苷酶的作用,其 IC50分别为 0.530、0.445和0.460 mg/mL。

α-葡萄糖苷酶抑制剂可用于治疗糖尿病、肥胖症以及病毒性感冒。构树生长容易,我国的资源丰富,阐明其具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分将为有效利用这类自然资源提供科学依据。

1 China Pharmaceutical University(中国药科大学).CollectionWords of ChineseMateriaMedica(中药辞海),Vol.2, Beijing:ChinaMedico-Pharmacological Science and Technology Publishing House,1996.695,

2 Shibano M,Kitagawa S,Kusano G,Studies on the constituents ofB roussonetiaspecies.I.Two new pyrrolidine alkaloids,broussonetines C and D,asβ-galactosidase andβ-mannosidase inhibitors fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1997,45:505-508.

3 Shibano M,Kitagawa S,Nakamura S,et al.Studies on t he constituent s ofB roussonetiaspecies.Ⅱ.Six new pyrrolidine alkaloids,broussonetine A,B,E,F and broussonetinine A and B,as inhibitors of glycosidases fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1997,45:700-705.

4 Shibano M,Nakamura S,Akazawa N,et al.Studies on the constituents ofBroussonetia species.III.Two new pyrrolidine alkaloids,broussonetines G and H,as inhibitors of glycosidase,fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull, 1998,46:1048-1050.

5 ShibanoM,Nakamura S,KuboriM,et al.Studies on the constituentsofBroussonetia species. IV.Two new pyrrolidinylpiperidine alkaloids,roussonetines I and J,fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1998,46:1416-1420.

6 ShibanoM,Nakamura S,Motoya N,et al.Studies on the constituents ofBroussonetia species.V.Two new pyrrolidine alkaloids,broussonetines K and L,as inhibitors of glycosidase, fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1999,47: 472-476.

7 ShibanoM,Tsukamoto D,Kusano G.A new pyrrolizidine alkaloid,broussonetine N,as an inhibitor of glycosidase,from B roussonetia kazinokiSieb.and absolute stereost ructures of broussonetinesA and B.Chem Phar m Bull,1999,47:907-908.

8 Shibano M,Tsukamoto D,Fujimoto R,et al.Studies on t he constituent s ofB roussonetiaspecies.V II.Four new pyrrolidine alkaloids,broussonetinesM,O,P,and Q,as inhibitorsof glycosidase,fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,2000,48:1281-1285.

9 Tsukamoto D,Shibano M,Okamoto R,et al.Studies on the constituents ofBroussonetia speciesⅧ,Four new pyrrolidine alkaloids,broussonetines R,S,T,and V and a new pyrroline alkaloid,broussonetine U,fromB roussonetia kazinokiSieb, Chem Phar m Bull,2001,49:492-496.

10 Tsukamoto D,ShibanoM,Kusano G.Studies on the constituents of Broussonetia speciesⅩ.Six new alkaloids from B roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,2001,49: 1487-1491.

11 Lee DH,Kinghorn AD.Bioactive compounds from the genus Broussonetia.Stud Nat Prod chem,2003,28:3-33.

12 Li ZQ(李子清),Yu k(喻凯),Zhao HY(赵焕英).The development and application of a screening model for intestineα-Glycosidase inhibitor.J Southwest Jiaotong Univ(西南交通大学学报).2006,41(增刊):152-154

13 Jolad SD,Hoffmann JJ,Cole JR,et al.Cytotoxic agent from Penstemon deustus(Scrophulariaceae):isolation and stereochemistry of liriodendrin,a symmetrically substituted furofuranoid lignan diglucoside.J O rg Chem,1980,45:1327-1329.

14 Akihisa T,Qinuma H,Yasukawa K,et al.Helianol 3,4-seco-19(10→9)abeo-8α,9β,10α-eupha-4,24-dien-3-ol,a novel triterpene alcohol from the tabular flowers ofHelianthus annuusL..Chem Phar m Bull,1996,44:1255-1257.

15 Heigh tman TD,Vasella AT.Recent insights in inhibition, structure,and mechanism of configuration-retaining glycosidases.Angew Chem,int ed,1999,38:750-770.

Chem ical Constituents withα-Glycosidase Inhibiting Activity from the Bark ofB roussonetia papyrifera

BAO Ling1,CU IWen-feng2,YU Jian-ping2,YU Kai3,WANGMing-kui1＊1Key Laboratory of M ountain Ecological Restoration and B ioresource U tilization of CAS,Ecological Restoration and B iodiversity Conservation Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu Institute of B iology,Chinese Academ y of Sciences,Chengdu 610041;2The College of B iology in Guizhou University Gui Yang 550025;3School of Life Science&Engineering,Southwest Jiaotong University,Chengdu610013

Theα-glycosidase inhibitorswere isolated and identified from the bark ofB roussonetia papyrifera.By solvent extraction and column chromatography,six compoundswere isolated from ethanolic extracts of this plant for the first time and identified as broussonetine A(1),broussonetinine A(2),broussonetinine B(3),liriodendrin(4),butyrospermyl acetate(5),and daucosterol(6)by spectral evidence.Activity assay indicated that compounds 1-3 had strong glycosidase inhibiting activitieswith IC50value of 0.530,0.445,and 0.460 mg/mL,respectively.

B roussonetia papyrifera;broussonetine A;broussonetinine A;broussonetinine B;glycosidase inhibitor

1001-6880(2010)06-0934-04

2009-02-11 接受日期:2009-04-01

四川省应用基础研究项目 (2007J13-059)

＊通讯作者 Tel:86-28-85229073;E-mail:wangmk@cib.ac.cn

Q946.91;R284.1

A