VEGFR2低表达的CRL2830细胞体外模型的建立和生物学特性研究＊

刘 斌,童春义

(湖南大学生物学院,湖南长沙 410082)

多囊肾(ADPKD)是一种由PKD1和PKD2突变引起的发病率在1/400～1/1000的常染色体显性遗传病,临床症状主要表现为肾囊肿的出现和肾功能丧失[1-3].研究表明:囊肿生长除了与基因突变相关外[1],还与囊肿上皮细胞产生的细胞因子、生长因子和趋化因子表达水平有着密切联系[4-6];此外,囊肿的生长和转移还依赖于周围新生血管的形成[7],因此通过阻断血液供应抑制囊肿生长的方法为多囊肾治疗提供了一条新的思路.

已有研究表明:血管内皮细胞生长因子受体参与多囊肾囊肿周围新生内皮细胞的迁移、增殖和凋亡[6-8],抑制受体VEGFR2表达能有效降低ADPKD细胞分泌VEGF的能力和细胞侵袭能力[8-10],然而关于直接抑制VEGFR2对囊肿形成的研究报道较少.为此,本文采用shRNA技术靶向性抑制多囊肾细胞中的VEGFR2表达,结合3-D培养技术建立多囊肾模型,来进一步考察VEGFR2表达抑制对多囊肾囊肿生长发育的影响,并对该基因作为治疗靶点的可能性进行初步探讨.

1 材料和方法

1.1 材料

CRL2830细胞购自ATCC;I型胶原蛋白购自BD Biosciences公司;经筛选后的VEGFR2 shRNA购自Open Biosystems公司(Huntsville,AL);VEGFR2抗体、β-actin抗体、羊抗兔二抗和ECL显影试剂盒购自美国Santa Cruz公司;VEGFR2上游引物为:5'-CTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACT-3',下游引物为5'-TGGTCATCAGCCCACTGGAT-3';内对照GAPDH上游引物为:5'-AACGACCCCTTCAT TG AC-3',下游引物序列为:5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'.

1.2 细胞培养和基因转染

CRL2830细胞在含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素的DMEM培养基的6孔板中培养.当培养细胞融合率达到80%左右时,用无血清的DMEM培养基洗2～3遍,每孔加入含3 μ g VEGFR2 shRNA、3 μ L Lipofectamine 2000脂质体和10 μ L无血清培养基的混合液进行转染,37℃孵育5 h后弃无血清培养基,换用含10%小牛血清的DMEM完全培养基继续培养.

1.3 阳性克隆的筛选与鉴定

细胞转染24 h后按1∶4的比例将细胞传代,加入含600 mg/L G418的培养基进行筛选,每4 d换液一次,约2周后筛选得到阳性克隆,倒掉培养基,在显微镜下用记号笔将克隆圈出,用胰酶浸湿的小滤纸片在克隆上放置3～5 min后转移到24孔板中继续培养,将长满的细胞转到35 mm培养皿中扩大培养,维持培养基中G418浓度为600 mg/L,利用RT-PCR法和Western blot筛选VEGFR2低表达细胞克隆.

1.4 细胞生长曲线的测定

取各种对数生长期细胞按1×103/孔接种于96孔板,24 h后每日取3孔细胞,用血红细胞计数板分别计数,取其平均值并绘制生长曲线.

1.5 3-D培养考察细胞cyst的生长速度

3-D细胞培养见参考文献[11]并略作修改,将细胞悬浮液与终浓度为2 mg/mL的胶原蛋白混匀后加入24孔板的小孔中,置于37℃培养箱凝固30 min后,加入完全培养基继续培养,每隔24 h将细胞置于倒置显微镜下进行囊肿的形态观察和体积测定.

1.6 Western Blotting分析蛋白质的表达

取各组细胞100 μ g全蛋白在不连续SDSPAGE胶中电泳,将蛋白质电转移至硝酸纤维膜上,丽春红S染色检测蛋白质转膜效率,5%脱脂奶粉封膜2 h,TBS洗涤3次,加入一抗孵育8 h,TBS洗涤3次,加入二抗孵育3 h,TBS洗涤,用ECL免疫荧光印迹试剂盒显色,曝光洗片,并重复3次.用Image J软件对胶片进行灰度分析,计算3种细胞中VEGFR2和β-actin蛋白的灰度比值.

2 实验结果

2.1 VEGFR2低表达的人CRL2830细胞系的建立和鉴定

从转录和翻译水平检测VEGFR2 shRNA转染对CRL2830细胞VEGFR2表达水平影响,从实验结果可见:转染空白对照Scr-shRNA不影响细胞中的VEGFR2表达,而转染VEGFR2 shRNA后导致VEGFR2在mRNA和蛋白质水平上均显著降低,其抑制程度接近70%(图1);接着采用细胞计数法考察了VEGFR2表达抑制对贴壁培养的3种细胞生长速度的影响,对不同细胞生长曲线(图2)进行统计学分析发现考察的3种细胞生长速度没有明显差异,提示VEGFR2没有显著调节细胞生长和增殖的能力.

图1 利用RT-PCR和Western blotting法检测CRL2830细胞分别转染VEGFR2-shRNA对VEGFR2的表达影响Fig.1 The effect of shRNA transfection on VEGFR2 level of CRL2830 cells

图2 不同VEGFR2表达水平的细胞生长曲线Fig.2 Growth curve of cells with different VEGFR2 expression

2.2 VEGFR2低表达诱导CRL2830细胞形态变化

虽然VEGFR2表达抑制没有影响细胞的生长速度,但能引起细胞形态结构的明显变化,表现为VEGFR2低表达的细胞与细胞之间接触变得疏松,细胞粘附能力显著下降,细胞形态也由长梭形向多边形变化,细胞核体积明显增大,细胞容易呈团状生长(图3);接着采用细胞划痕实验来考察VEGFR2表达抑制对细胞侵袭能力的影响,在观察时间内(48 h)不同细胞之间的迁移速度没有明显差异,这表明VEGFR2表达变化未改变细胞迁移能力(结果略).

图3 转染VEGFR2-shRNA后CRL2830细胞的形态变化观察(40×)Fig.3 Morphological change of CRL2830 cells transfected with VEGFR2-shRNA or not

2.3 胶原蛋白浓度对细胞囊肿形成的影响

用3-D方式培养细胞时发现:在终浓度为2 mg/mL的胶原基质中3种细胞均能形成规则的囊肿结构,基质浓度为1.5～1.8 mg/mL时,部分培养细胞形成囊肿结构,其他细胞则形成管状结构;胶原浓度低于1.5 mg/mL时3种细胞均以管状形式存在,无法形成规则的囊肿结构(图4).

图4 胶原蛋白浓度对CRL2830细胞形成囊肿的影响(3 d)Fig.4 The influence of collagen concentration on cyst formation of CRL2830 cells(3 d)

2.4 VEGFR2低表达显著降低囊肿的生长速度

将3种细胞分别培养在终浓度为2 mg/mL的胶原基质中,显微镜下每天测量15个囊肿的直径变化,并计算平均值.统计结果表明:在形成囊肿的前2 d,3种不同细胞形成的囊肿形状和大小未表现出明显差异;从第3 d开始,VEGFR2低表达细胞的囊肿直径明显小于对照细胞;至第5 d时,低表达VEGFR2的囊肿直径仅为对照囊肿直径的50%(图5为不同细胞形成囊肿的生长曲线,图6为不同细胞形成的囊肿结构);低表达VEGFR2的囊肿细胞自第6 d开始大量凋亡,细胞表现出典型的凋亡特征,至第7 d细胞几乎完全裂解;而对照组细胞随着培养时间的延长和胶原蛋白浓度降低,球形囊肿结构开始多个突起,并逐渐分化为管状分支结构.

图5 不同VEGFR2表达水平的CL2830细胞囊肿生长速度比较Fig.5 Comparison of growth speed of cysts formed by different CRL2830 cells

3 讨 论

研究表明:各种细胞因子、生长因子和趋化因子在多囊肾的发病过程中起着关键的作用[5-6],如VEGF能通过自分泌、旁分泌方式与VEGFR2结合后刺激囊肿衬里上皮细胞分裂增殖,最终导致囊肿的发生及增大[7-8];此外,VEGFR2在囊肿血管生成和造血过程中也具有重要的生理功能,采用VEGF受体抑制剂SU5416切断VEGF信号途径后囊肿生长速度显著降低,囊液中的VEGF含量显著下降[12-13],这些研究结果提示了VEGFR2在多囊肾发生发展过程中具有重要作用.然而采用狗源性MDCK细胞和小鼠模型开展人多囊肾研究得到的结果无法真实地反映人源性多囊肾的发病过程[14].为此,本文以人源性CRL283细胞为材料,首次成功建立了人源性多囊肾细胞3-D模型,为该病的分子机制研究以及多囊肾治疗和药物开发研究提供了一种理想的实验模型.

图6 CRL2830、Scr-shRNA与VEGFR2-shRNA细胞形成囊肿的显微成像结果(10×)Fig.6 The image of cysts formed by CRL2830、Scr-shRNA与VEGFR2-shRNA under microscope

实验研究结果发现:抑制VEGFR2表达后虽然未影响贴壁培养细胞的生长速度,然而细胞的形态结构发生了明显改变,形成的囊肿生长速度显著低于对照细胞囊肿的生长速度,这与利用动物模型得到的结果一致;此外还发现:VEGFR2表达抑制能显著诱导囊肿细胞早期凋亡并最终导致囊肿破裂;而抑制另外一种血管生成因子受体——VEGFR1后,囊肿生长速度以及细胞凋亡程度与对照组细胞几乎没有差异,为此推测:SU5416抑制多囊肾的进程主要是通过抑制VEGF/VEGFR2信号途径实现的,靶向性抑制VEGFR2将成为有效治疗多囊肾的有效手段之一.

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