体外循环对血小板 CD40L表达的影响

龚琪 谈凌凌 林薇 王哲 徐振海

体外循环对血小板 CD40L表达的影响

龚琪 谈凌凌 林薇 王哲 徐振海

目的 研究体外循环(CPB)过程中血小板膜表达CD40L的变化,及其与血小板激活、全身炎症反应及凝血变化的联系。方法 CPB心内直视手术患者 40例,分别于麻醉诱导后 10min(T1)、CPB后 30m in(T2)、CPB停机即刻(T3)、CPB后 2h(T4)、4 h(T5)、8h(T6),抽取外周动脉血,测定血浆 TNF-α浓度、血小板表面CD 40L和 CD 62P表达,计算术后 24 h纵隔引流量。结果 T2时 CD 40L较 CPB前明显升高(P＜0.01),T3时达到峰值,T6时恢复到T1水平。血小板 CD 62P表达、血浆肿瘤坏死因子-α的峰值、术后 24 h引流量均和CD 40L表达呈正相关(r=0.610,P＜0.01)。结论 CD40L是随着CPB对血小板的激活而表达的,CD 40L可能是联系炎性反应和凝血异常这两个导致CPB术后主要并发症的一个重要环节。

体外循环;血小板;CD40L;并发症

体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)激活血小板引起机体的炎性反应以及凝血功能的变化是心脏外科手术术后出血、栓塞、心肌损伤、多器官功能衰竭等一系列并发症的病理基础[1],但其机制尚未完全阐明。CD 40L作为由血小板表达又和炎症、凝血有关的一种蛋白,当某种条件下血小板被激活后,迅速表达于血小板表面,并可和其裂解生成的血浆可溶产物sCD 40L(Soluble CD 40L)共同发挥生理作用,体内的CD40L主要来源于血小板[2]。本试验通过检测行心内直视手术患者在CPB前后多个时间点血小板膜表达CD40L和血小板激活标志物 CD 62P的情况、血浆中的炎性反应标志物肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度及患者术后 24h纵隔引流量来探讨 CPB对血小板表达 CD 40L的影响,CD 40L和血小板激活标志物 CD 62P、炎性反应标志物 TNF-α、术后出血量的关系,从而对 CPB过程中血小板CD40L的表达规律以及其与CPB引起的炎症、凝血异常的关系做探讨,为更有效的减少CPB并发症从而提高手术效果提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2006年 1至 12月在我科住院行心内直视手术的房室水平左向右分流的先天性心脏病(先心病)患儿40例,其中男 26例,女 14例;年龄 7个月 ～13岁,平均年龄(2.1±1.8)岁;体重 7～28 kg,平均体重(13±8)kg;病种为室间隔缺损 31例,房间隔缺损 9例;以上病例均无伴发血液系统、肝肾等系统疾病,术前无感染及免疫系统异常,无非甾体类抗炎药、激素、免疫调节剂用药史。麻醉诱导予以氯胺酮、芬太尼,均采用气管插管静脉及吸入复合麻醉,麻醉维持予以芬太尼、异丙酚和安氟醚。所有患儿均采用胸骨正中切口,常规主动脉及上下腔静脉插管建立 CPB,采用美国 Sarns-8000人工心肺机,美国Dideco膜式氧合器和宁波菲拉尔微栓过滤器。血定安、复方氯化钠溶液预充,转机前肝素化抗凝(3 mg/kg),CPB中追加肝素,保持激活全血凝固时间(ACT)＞480 s。血液中度稀释,浅中度降温。动脉流量 80～150ml◦m in-1◦kg-1,CPB中维持平均动脉压 40～60mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)。改良 St.Thomas晶体心肌保护液间断主动脉根部灌注。停机后按1∶1用量以鱼精蛋白中和肝素。术后根据病情输去白悬浮红细胞和新鲜冷冻血浆,全组患者未出现死亡及二次开胸止血的情况。升主动脉阻断时间 13～68min;平均(28±13)m in;CPB时间 36～115m in,平均(49±26)m in。

1.2 标本采集与指标检测 分别于麻醉诱导后 10 min(T1),CPB后 30m in(T2),CPB停机即刻(T3),CPB后 2 h(T4)、4 h(T5)、8h(T6),抽取桡动脉血。分别予以 CD 62P单克隆抗体(美国PHARMINGEN公司),CD 40L单克隆抗体(美国 Ancell公司)标记血小板后加入荧光二抗,采用流式细胞分析技术上机(美国 BD公司 FACS420型流式细胞仪)各检测 20 000个血小板,利用HP-300Consort 30计算机细胞分析软件计算平均荧光强度(MFI)进行资料采集和分析。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(美国 RB公司)应用意大利西亚克公司的ALISAI酶免自动分析仪,测量血清 TNF-α。于术后24 h统计患者纵隔引流总量,结果以每千克体重出血毫升数(ml/kg)表示。

1.3 统计学分析 应用 SPSS 12.0统计软件,计量资料以±s表示,采用单因素方差分析和Pearson直线相关分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

T2血小板膜表达 CD 40L已比 CPB前明显升高(P＜0.01),在 T3时达到峰值,随后开始下降,T6时恢复到 CPB前水平(P＞0.05)。CD62P在 T2时明显升高(P＜0.01),在 T3时达到峰值,T6时回到基线水平(P＞0.05),在CPB前后所测定的几个时间点上,它的表达量和相同时间点的 CD 40L均呈正相关 (r值 分别为 0.563、0.657、0.691、0.580、 0.575和0.448,P＜0.05)。血浆 TNF-α在 CPB后开始升高,T3时达到峰值,与T1比差异有统计学意义(P＜0.01),随后开始下降。TNF-α峰值与 CD 40L峰值呈正相关(r=0.577,P＜0.01)。术后 24h纵隔引流量为 4.88～15.46m l/kg,平均(9.7±2.7)m l/kg;24h纵隔引流量和 CD 40L峰值呈正相关(r=0.610,P＜0.01)。见表 1。

表1 CPB中不同时间血小板膜表达CD 40L和CD62P与血浆TNF-α浓度比较n=40,±s

表1 CPB中不同时间血小板膜表达CD 40L和CD62P与血浆TNF-α浓度比较n=40,±s

注：与T 1比较,＊P＜0.05,#P＜0.01

项目 T1 T 2 T3 T4 T5 T6 CD40L(MFI) 1.8±0.4 4.3±0.9＊ 6.5±1.6# 5.7±1.4# 4.5±1.2# 1.9±0.4 CD62P(MFI) 1.6±0.4 3.8±0.8# 5.6±1.3# 5.1±1.2# 3.9±0.8# 1.7±0.3 TNF-α(pg/m l) 4.5±0.3 9.2±1.1＊ 16.9±1.2# 15.6±1.2# 13.9±1.1# 12.8±1.0

3 讨论

CD40L是一种跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子家族,研究表明人体内 CD 40L及其血浆可溶产物sCD 40L的来源主要为激活后的血小板[2-4]。血小板活化后其颗粒内容物之一的 α颗粒膜与血小板质膜融合并迅速在血小板膜表面上大量表达的 CD 62P是血小板活化的特异标志[5]。血小板激活是体内多种复杂条件互相影响、互相联系的一个结果,CD 62P和 CD40L存在位置和激活条件不同,所以不同条件下血小板被激活后表达时间、表达量和方式可能有差异[6]。CPB是一种非生理环境下的治疗手段,引起大量的血小板激活[7]。本试验中 CPB时CD62P的表达在时间规律上和 CD 40L完全相同,在几个时间点上直线相关分析均呈正相关(P＜0.05)。说明 CPB由于异物表面、剪切力等原因引起的由 CD62P代表的血小板激活和CD40L的外化过程几乎是同步进行的,且这种过程一直持续到术后早期。所以我们认为 CPB时血小板膜 CD40L可以和CD62P一样作为血小板一种标志物而反映血小板的激活情况。

CPB时血液的破坏、缺血再灌损伤、手术创伤、补体激活、内毒素释放等原因致使体内大量炎性介质的释放导致全身炎性反应,这是CPB术后一系列并发症包括多器官功能衰竭的病理基础[8]。TNF-α是一种主要由单核巨噬细胞分泌的细胞因子,可以由于CPB而大量释放从而介导炎性反应,且其与血浆中 TNF-α的水平呈正相关(P＜0.01),可通过监测血浆中TNF-α水平来间接反映全身炎症状况的程度[9]。本研究中发现 TNF-α峰值与 CD40L峰值之间呈正相关关系(r=0.577,P＜0.01),说明 CD 40L并不仅仅是血小板激活的标志物,可能对于 CPB术后全身炎性反应起作用,而且也可以象 TNF-α一样对 CPB所导致的全身炎性反应、术后的并发症作出一定的预测,这为研究CPB引起的全身性炎症、血栓反应的机制及有针对性的采取治疗措施提供了一个新的思路。CD 40L或 sCD40L通过结合血小板自身表达的GPⅡb/Ⅲa从而引起血小板聚集,是稳定血小板血栓和导致血小板自身激活的活性物质[10]。CPB所导致的并发症除了可由炎性反应引起外,还有很大一部分是由于凝血功能异常所导致,所以CPB围术期的脑损伤、心肌损伤可能也与此有关,而且由于血小板数量减少和功能异常引起术后出血。本研究中发现 CD 40L峰值和 24h引流量呈正相关关系(r=0.610,P＜0.01),从而我们推测CPB导致血小板激活引起的凝血功能障碍中 CD 40L可能是其中一个环节,其部分作用是通过 CD 40L和血小板互相作用来实现的。

我们的研究则描述了CPB过程中CD40L的动态变化并初步揭示了其和 CD 62P代表的血小板激活之间联系,而且还发现 CPB中血小板表达 CD40L的高低和全身炎性反应标志物TNF-α及术后纵隔引流量都呈正相关关系(P＜0.01),说明血小板可能就是通过 CD40L系统成为联系这两个过程的纽带,对它深入研究将对理解CPB导致机体损伤的病理生理学机制,从而为有针对性的采取更好的措施预防和治疗 CPB引起的出血、炎症并发症,提高手术效果和安全性起到积极的作用。但本试验仅从大体上作了CPB对血小板激活引起CD40L的表达规律及其和 CD 62P、TNF-α、术后出血量的关系分析,并未在更深入的层次上研究它们的相互作用关系及其机制。而且出于对误差控制的考虑,选取的病例病种较为单一且病情较轻。

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The effect of cardiopu lmonary bypass in the exp ression o f CD 40 ligand on p lateletmembrane

GONG Qi, TAN Lingling,LINWei,eta l.Departmentof Thoracic and Cardiovascu lar Surgery,The Fourth Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050011,China

Objective To observe the effect of cardiopulmonary bypass(CPB)in the expression of CD40 ligand(CD40L)on p lateletsmembrane,and to investigate the correlation between platelet stimulation,systemic inflammation and coagulation.M ethods 40 patients undergoing open heart operation by CPB were studied.Blood samp leswere collected from peripheral arterial 10 minutes after anesthesia induction(T1),30minutes after CPB(T2),instant on the termination of CPB(T3),after 2 hours(T4),4 hours(T5),8 hours and at the term ination of CPB(T6).The expression of CD 40L and CD 62P on plateletmembrane,plasma TNF-αconcentration,totalamount of bleeding after 24-hour CPB were detected.Resu lts The expression levels of CD 40L on plateletmembrane were significantly increased after CPB(P＜0.01),which reached its peak at the term ination of CPB and returned to the baseline after 8 hours.The CD 40L was significantly correlated with CD 62P,TNF-αand the amount of bleeding respectively(P＜0.01).Conclusion The expression of CD40L on plateletmembrane increaseswith the p lateletactivation caused by CPB.The platelet-derived CD 40Lmay be involved in both the thrombotic and inflammatory events accompanied with CPB.

cardiopulmonary bypass;p latelet;CD 40L;comp lications

R 654.1

A

1002-7386(2010)07-0797-03

050011 石家庄市,河北医科大学第四医院胸心外科

2009-12-14)