柑橘叶片蛋白质高效提取与溃疡病PthA蛋白质Western blot分析

李娜，覃磊，严佳文，陈佩，邓子牛*

（1.湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128; 2.湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙 410128）

柑橘叶片中蛋白质含量低，所含有的盐、有机酸、色素、酚、多糖等物质干扰蛋白质样品的制备．柑橘溃疡病（Citrusbacterial canker disease）是一种世界性的检疫性病害，病原基因pthA是致病所必需的因子[1]．笔者前期以柑橘溃疡病致病基因pthA为出发点，利用病原基因诱导植物获得抗性原理，已将致病基因pthA的核定位信号NLSs导入感病甜橙中．笔者研究柑橘叶片蛋白质的提取，旨在建立一套适合SDS-PAGE电泳、质谱分析和Western blot的蛋白质提取方法；对柑橘溃疡病致病基因pthA诱导表达的PthA进行Western blot分析，将致病基因pthA导入甜橙中，使表达蛋白质具有免疫反应活性，为PthA抗病机理的研究提供理论基础．

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为普通糖橙、普通冰糖橙、转pthA-nls基因糖橙和转pthA-nls基因冰糖橙的叶片，均采自国家柑橘改良中心长沙分中心温室．抗PthA-NLS多肽单克隆抗体由湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室保存；Bradford蛋白质定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体、增强型辣根过氧化物酶底物显色试剂盒（HRP-DAB）购自天根生化科技北京有限公司．匀浆机为德国IKA公司生产的T10，电泳设备为美国GE公司生产，转印设备为美国伯乐公司生产．MALDI TOF/TOF质谱仪及相关软件均为德国布鲁克·道尔顿公司生产．

1.2 方 法

1.2.1 柑橘叶片蛋白质的提取

（1） 用改良PBS法提取：对Ren等[2]报道的方法进行优化．取叶片约0.5 g，洗净，加入液氮研磨成粉末后加入10 mL离心管中，立即加入3 mL PBS （NaCl 137 mmoL/L，KCl 2.7 mmoL/L，Na2HPO410 mmoL/L，KH2PO41.76 mmoL/L，pH 7.4），混匀，在冰水混合物中匀浆，离心（9 500 g，15 min，4 ℃），取上清液，超声破碎（开8 s，停5 s，共3 min），离心（12 000g，15 min，4 ℃），取上清液．

（2） 用Tris-HCl法[3-5]提取．

（3） 用三氯乙酸-丙酮法[6-7]提取．

1.2.2 蛋白质含量的测定

用Bradford蛋白质定量试剂盒进行定量，含考马斯亮兰G-250染色液和牛血清白蛋白（BSA）标准蛋白质溶液，测定595 nm波长下的吸光值，以不含BSA的样品为空白对照，绘制标准曲线，计算样品中蛋白质的含量．

1.2.3 钠十二烷基的硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳

12%分离胶及5%浓缩胶制备参照文献[8]．将样品置于5×凝胶加样缓冲液中，100 ℃加热5 min，以使蛋白质变性．等量加样，重复，同时200 V等压SDS-PAGE电泳．电泳结束后另一块胶考马斯亮兰染色（0.1%考马斯亮兰R-250，50%甲醇，10%冰醋酸，40%蒸馏水）1 h，脱色（5%甲醇，7%冰醋酸，88%蒸馏水）2 h．胶片灯上观察，拍照．

1.2.4 质谱鉴定

用 MALDI TOF/TOF 进行质谱分析，通过Mascot查询NCBI 数据库，如果Mascot 分数高于66分（P＜ 0.05） 则认为得到阳性鉴定，分数越大匹配程度越高，否则视为未得到鉴定．将凝胶上的蛋白质条带切下，胶内酶解，将酶解产物浓缩后点于Anchorchip 样品靶上，与 α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA） 共结晶，室温干燥后，用MALDI TOF/TOF进行鉴定，获得的质谱图经软件Flex Analysis 3.0分析后，用Biotools 3.0 软件进行数据库搜索.

1.2.5 溃疡病PthA蛋白质的Western blot分析

从转pthA-nls基因冰糖橙、转pthA-nls基因糖橙和未转化普通冰糖橙、普通糖橙叶片中提取可溶性总蛋白质，经SDS-PAGE电泳，电转移至硝酸纤维素膜进行Western印迹杂交．将凝胶、滤纸、0.45 μL硝酸纤维素膜（NC）置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15 min后，恒压100 V在1 L含20%甲醛电极缓冲液中转移90 min，将NC膜置于封闭液中封闭．漂洗，加入相应的抗PthA-NLS多肽单克隆抗体（1∶1 000稀释）[9-10]孵育，洗涤．加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体，室温下于摇床孵育，洗涤，用HRP-DAB试剂盒在室温下染色8 min，显色后拍照．

2 结果与分析

2.1 不同方法提取柑橘叶片蛋白质的效果

利用三氯乙酸-丙酮法、Tris-HCl提取法、改良的PBS法对0.5 g柑橘叶片进行了蛋白质提取，并对得到的蛋白质液的浓度、体积、技术繁琐程度进行比较（表1）．

表 1 不同方法提取柑橘叶片蛋白质的效果Table 1 Results comparison in different protein extraction methods

从表1可以看出，3种方法提取的蛋白质效果及电泳结果差异较大，其中以改良PBS法的效果最好．用该方法提取的蛋白质液浓度较高，量多，能满足平行试验需要，而且技术操作简单，费时少，所需试剂少，成本低，所用试剂比使用丙酮、三氯乙酸等有机溶剂环保、无公害，有利于试验操作者的身体健康．

2.2 不同方法提取蛋白质的SDS-PAGE电泳结果

图1结果表明，1～2泳道带型模糊，蛋白质浓度低；3～4泳道背景较深，蛋白质浓度较低；5～8泳道带型清晰可见．

图 1 不同方法提取蛋白质的SDS-PAGE电泳结果Fig.1 SDS-PAGE results of different extraction methods

2.3 质谱鉴定结果

在鉴定的2个特异性蛋白质条带中，Mascot得分分别为400和177，说明结果准确可靠．鉴定结果见表2，与已报道的柑橘属已知蛋白质匹配，表明经SDS-PAGE电泳分离的目的蛋白质已达到质谱对样品的要求．

表 2 蛋白质质谱鉴定结果Table 2 Proteins identified by MALDⅠ TOF/TOF

2.4 溃疡病PthA蛋白质的Western blot分析结果

图2结果表明，转pthA-nls基因冰糖橙、转pthA-nls基因糖橙在相对分子质量48 000处呈阳性免疫性反应，与阳性对照（PthA重组蛋白质）一致，而未转化普通冰糖橙、普通糖橙无条带，说明pthA-nls基因已整合进甜橙基因组并获得表达，表达蛋白质具有免疫反应活性．

图2 溃疡病PthA蛋白质的Western blot分析结果Fig.2 Western blot results of transgenic pthA-nls plants

3 结论与讨论

提取的蛋白质质量直接关系到Western blot及后续其他蛋白质组学试验的成败．传统的三氯乙酸-丙酮法[11]是很有效的蛋白质沉淀方法，能够消除瞬时的蛋白质水解作用和其他蛋白质酶的修饰，其最大的缺点是蛋白质很难重新溶解，步骤较繁琐，耗时较多．Tris-HCl提取法经丙酮反复清洗，虽能较好地脱去盐离子[12]，但损失较大，所得蛋白质条带数少．改良PBS法在试验中加以超声波处理，使混合液均匀，大大增加了与提取液的接触面积[13]，进而提高了蛋白质样品的质量．该技术操作简单，适合柑橘叶片蛋白质的提取，且提取的蛋白质经SDS-PAGE电泳可得到带型清晰、表达量较高的目的条带，并可直接用于质谱鉴定．

柑橘溃疡病致病基因pthA是亚洲型（A型）病菌引发病症所必需的因子．pthA基因位于柑橘溃疡病菌大质粒上，Swarup[14]在1991年克隆得到pthA基因全长，共有4 275 bp，编码1 163个氨基酸残基，其中核定位信号区（NLSS）是致病基因pthA的重要功能区和识别定位于寄主细胞的关键部位．点突变核定位信号区不能对柑橘诱发溃疡病，但对非寄主植物土豆能诱发病症，说明核定位信号是柑橘溃疡病的致病关键因素，阻止其发挥功能，就有可能实现抗病．前期已将pthA-nls基因转入感病品种糖橙和冰糖橙中，希望阻断其致病途径，从而实现抗病；或者使致病基因pthA的核定位信号NLSs在甜橙中过量表达，使原有致病蛋白质失去功能，或表达蛋白质失去原有的时空性，或表达蛋白质激活甜橙本身的防御系统，从而干扰病原菌的正常生理代谢，以致转基因甜橙表现出抗性．本研究结果证实了pthA-nls基因已整合进甜橙基因组并获得表达，表达蛋白质具有免疫反应活性，为进一步研究PthA的抗病机理奠定了基础．

[1] 胡春华，徐磊，马先锋，等．PthA核定位信号肽抗血清制备及其对柑橘溃疡病的抑制作用[J]．园艺学报，2008，35（6）：811-818．

[2] Ren G Y，Li B F，Zhao X，et al．Screening of extraction methods for glycoproteins from jellyfish （Rhopilema esculentum） oral-arms by high performance liquid chromatography[J]．J Ocean Univ China （Oceanic and Coastal Sea Research），2009，8（1）：83-88．

[3] 王彩霞，罗丽．成年态柑橘离体植株中特异表达蛋白质的初步研究[J]．中国农学通报，2009，25（7）： 70-72．

[4] Audrius A Z，Andrew P．Extraction methods for analysis ofCitrusleaf proteins by two-dimensional gel electrophoresis[J]．Journal of Chromatography A，2005，1078：201-205．

[5] 谷瑞升，刘群录，陈雪梅，等．木本植物蛋白质提取和SDS-PAGE分析方法的比较和优化[J]．植物学通报，1999，16（2）：171-177．

[6] 曾广娟，李春敏，张新忠，等．适于SDS-PAGE分析的苹果叶片蛋白质提取方法[J]．华北农学报，2009， 24（2）：75-78．

[7] Rakwal R，Komatsu S．Role of jasmonate in the rice（Oryza sativaL.） self-defense mechanism using proteome analysis[J]．Eletrophoresis，2000，21：2492-2500．

[8] 郑亚军，李艳，李新菊，等．不同SDS-PAGE分离胶浓度下椰子贮藏蛋白质亚基的分离效果[J]．中国农学通报，2008，24（9）：452-456．

[9] 胡春华，龙桂友，戴素明，等．抗PthA-NLS 多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建[J]．中国农业科学，2009，42（3）：884-890．

[10] Li N，Hu C H，Long G Y，et al．Preparation of monoclonal antibody against PthA-NLS and cloning of the relativeScFvgene[J]．Agricultural Sciences in China，2010，9（1）：101-105．

[11] 曾广娟，李春敏，张新忠，等．苹果叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较[J]．中国农学通报，2008，24（8）：105-109．

[12] 范吉星，邓用川，黄惜，等．红海榄根部总蛋白质提取方法的改进和双向电泳体系的建立[J]．湖南农业大学学报：自然科学版，2008，34（5）：549-553．

[13] 袁坤，王明庥，黄敏仁．一种适合杨树叶片的蛋白质提取方法[J]．南京林业大学学报：自然科学版，2007，31（3）：118-120．

[14] Swarup S，Yang Y，Kingsley M T．AXanthomonas citripathogenicity genepthApleiotropically encodes gratuityous avirulence on nonhosts[J]．Mol Plant Microbe Interact，1992，5：204-213．

英文编辑：罗文翠