用均匀设计优选苦参半仿生提取法工艺条件*

王英姿，惠建国，张兆旺，孙秀梅

（1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.山东中医药大学药学院，济南 250014）

用均匀设计优选苦参半仿生提取法工艺条件*

王英姿1，惠建国2，张兆旺2，孙秀梅2

（1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.山东中医药大学药学院，济南 250014）

[目的]优选苦参的半仿生提取法工艺条件。[方法]采用UL（91×33）均匀实验设计，以苦参碱、氧化苦参碱、苦参总碱、高效液相色谱（HPLC）总面积、干浸膏为指标综合评判，优选苦参半仿生提取的工艺条件。[结果]3煎用水的pH值依次为2.200 8、7.468 5、8.989 0；3煎总计时间为3.918 0 h。[结论]结合生产实际，确定3煎用水的pH值依次为2.0、7.5、9.0；提取时间依次为 2.0、1.0、1.0 h。

苦参；半仿生提取法；均匀设计；多成分指标；综合评判

苦参为清热燥湿，杀虫，利尿药。主含苦参碱、氧化苦参碱等生物碱以及黄酮等成分。苦参碱、氧化苦参碱及苦参总碱具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗心律失常、抗肿瘤等多方面药理作用。为体现其整体功能，根据半仿生提取法（SBE法）的理论[1-3]，以苦参碱、氧化苦参碱、苦参总碱、高效液相色谱（HPLC）总面积、浸膏得率为综合评判指标，采用均匀设计优选其SBE法的工艺条件。

1 仪器与材料

pHS-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）；MA110型电子分析天平（上海第二分析仪器厂）；LXJ－Ⅲ型离心沉淀机（上海医疗器械三厂）；Agilent 1100高效液相色谱仪。

苦参经张兆旺教授鉴定，为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根经加工制成的饮片。苦参碱对照品（批号：0805-200005，供含量测定用）、氧化苦参碱对照品（批号：0780-200004，供含量测定用）均购自中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 实验设计 根据SBE法理论，在药材粒度、煎煮温度、煎煮用水量、滤过等条件相同的前提下，确定考察的主要因素及水平，选用均匀设计法（UL）（91×33）表(中国航天工业总公司第三研究院提供)安排实验方案，见表1。

2.2 样品液的制备 称取苦参粗粉（10～20目之间）20.0 g，常压加热回流提取3次（加水量分别为苦参重量的10，8，8倍，溶剂水的pH值及提取时间按表2），提取液用4层纱布加100目筛分别滤过，离心（3 000r/min，15min），合并上清液，定容至 500 mL，即得1～9号样品液（每毫升相当于苦参0.04 g）。

表 1 UL（91×33）实验设计表Tab.1 Chart of UL（91×33）design

2.3 对照液的制备 精密称取苦参碱对照品15.60 mg，用乙腈-无水乙醇(80∶20)溶解并定容至25 mL，制成对照液A（每毫升含苦参碱0.624 mg）。

精密称取氧化苦参碱对照品17.68 mg，加乙腈－无水乙醇（80∶20）溶解并定容至 10 mL，制成对照液B（每毫升含苦参碱 1.768 mg）。

2.4 供试液的制备 精密量取2.2项下样品液10mL，加氨水调 pH 9～10，用氯仿萃取（20 mL，6次），合并萃取液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转移至25 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得1～9号供试液（每毫升相当于苦参0.016g）。

2.5 苦参碱及氧化苦参碱的含量测定

2.5.1 色谱条件[4]色谱柱：Lanbo NH2柱（250×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－无水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10）；流速：1 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.5.2 线性关系考察

2.5.2.1 苦参碱线性关系考察 精密吸取2.3项下对照液 A，用乙腈-无水乙醇（80∶20）稀释成 0.015 6、0.031 2、0.046 8、0.062 4、0.07 8、0.093 6 g/L 的对照液A1～6，按2.5.1项下色谱条件，依法测定。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程为：Y=11740X-32.585，r＝0.999 6，表明在0.0156～0.0936g/L浓度范围内线性关系良好。

2.5.2.2 氧化苦参碱线性关系考察 精密吸取2.3项下对照液B，用乙腈-无水乙醇（80∶20）稀释成0.044 2、0.132 6、0.221、0.309 4、0.397 8、0.486 2 g/L的对照液B1～6。按2.5.1项下色谱条件，依法测定。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得一条不过原点的直线，回归方程为：Y=10 524X+58.726，r＝0.999 2，表明在0.044 2～0.486 2 g/L范围内线性关系良好。

2.5.3 精密度实验

2.5.3.1 苦参碱精密度实验 取2.5.2.1项下苦参碱对照液 A3（0.046 8 g/L），按 2.5.1 项下色谱条件，重复进样6次，结果表明精密度良好，RSD=0.48%。

2.5.3.2 氧化苦参碱精密度实验 取2.5.2.2项下氧化苦参碱对照液 B3（0.221 g/L），按 2.5.1项下色谱条件，重复进样6次，结果表明精密度良好，RSD=0.72%。

2.5.4 稳定性实验 取2.4项下1号供试液，于0、2、4、6、8 h按2.5.1项下色谱条件，测定苦参碱和氧化苦参碱峰面积，结果表明稳定性较好，RSD分别为0.41%、0.55%。

2.5.5 重复性实验 取2.2项下1号样品液，按2.4项下供试液的制备方法平行提取5次，按2.5.1项下色谱条件，测定苦参碱和氧化苦参碱峰面积，结果表明重现性较好，RSD分别为0.71%、0.93%。

2.5.6 样品测定 吸取2.4项下供试液，按2.5.1项下色谱条件，依法测定，结果见表2。

2.5.7 加样回收实验

2.5.7.1 苦参碱加样回收实验 取2.2项下1号样品液4.5 mL（含苦参碱0.576 7 mg），加入2.3项下对照液A 1.0 mL，按2.4项下方法制备成供试液，测定苦参碱含量，计算回收率，结果回收率为97.52%，RSD 为 1.32%（n=5）。

2.5.7.2 氧化苦参碱加样回收实验 取2.2项下1号样品液5 mL（含氧化苦参碱3.036 4 mg），加入2.3项下对照液B 1.70 mL，按2.4项下方法制备成供试液，测定苦参碱含量，计算回收率，结果回收率为98.21%，RSD为1.51%（n=5）。

2.6 苦参总碱的含量测定 取2.4项下供试液15mL（相当于苦参0.24 g），置于三角瓶中，水浴蒸干，残渣加乙醚5 mL使溶解。精密加0.01 mol/L硫酸液10 mL，摇匀，水浴加热使残渣完全溶解，并除尽乙醚后放冷。加新沸过的冷蒸馏水15 mL与甲基红指示液2滴，用0.020 84 mol/L氢氧化钠试液滴定至黄色，即得。以乙醇15 mL和0.01 mol/L硫酸液10 mL作空白对照。按下式计算苦参总碱的含量（mg/g），结果见表2。苦参总碱含量（mg/g）=

式中：c―氢氧化钠滴定液摩尔浓度；v1―空白液消耗氢氧化钠滴定液毫升数；v―供试液消耗氢氧化钠滴定液毫升数；248―苦参碱（C15H24N2O）分子量。

2.7 HPLC总面积测定 取2.4项下供试液，按2.5.1项下色谱条件测定，记录总积分面积，结果见表2。

表2 综合各指标成分含量及标准化处理结果Tab.2 Results of the content of each ingredient and itscontent after the standard processing

2.8 干浸膏的测定 精密吸取2.2项下样品液各20 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃烘至恒质量，计算干浸膏含量。结果见表2（n=3）。

2.9 实验结果的处理 将苦参碱、氧化苦参碱、苦参总碱、HPLC总面积、干浸膏5个指标测定的数据按公式进行标准化处理。为标准化后的值，为样品液i中成分j的含量，为样品中i种成分j的平均值，为成分j的标准差。根据各指标在提取工艺选择中的主次地位，给予不同的加权系数，以标准化后的值加权后求和，即得综合评价Y值，结果见表2。

将表1中各实验水平的4个因素及表9中相应实验水平的综合指标Y值输入计算机，用JYSYSJ的数据分析模块处理，用二次多项式逐步回归，得回归方程：F=7.441 501-36.100 98×D+0.5288 306 ×A×A-0.703 579 2×C×C-4.506 316×D×D-0.475 532 7 ×A×C+1.087 29×B×B+7.035 472×C×D，r=0.999 998 5，F=49 066.55。查 F 值表 F0.05(7，1)=236.8，F0.05(7，1)

2.10 验证优化条件 按照2.9项下优选出的工艺条件，依2.5～2.8项下各指标的测定方法，依法进行3次重复实验，结果见表3。结果表明，验证实验提取液综合评价Y’值接近预测值（Y=12.723 5）。

3 小结与讨论

1）以苦参碱、氧化苦参碱、苦参总碱、HPLC总面积、干浸膏为指标，采用均匀设计法对药材SBE法工艺条件进行优选，结果：3煎用水pH依次为2.200 8、7.468 5、8.989 0，3 煎总计时间为 3.918 0 h。结合生产实际，确定其SBE法工艺条件为：3煎用水pH 依次为 2.0、7.5、9.0；提取时间依次为 2.0、1.0、1.0 h。验证实验结果接近预测值，说明优选条件可行。

表3 验证实验提取液中各指标成分含量的标准化值及综合评价值Tab 3 The standard and evaluated content of each ingredient in the extracting liquid

2）实验结果是按照半仿生提取法“有成分论，不惟成分论”理论，充分考虑到单体成分和活性混合物(多种成分)，根据各指标在工艺选择中的主次，给予不同的加权系数，确定综合评价Y值的关系式，并对5个指标数据进行标准化处理，以消除各指标单位和量纲的不同，以及各指标变量范围相差悬殊造成的影响，以标准化指标加权后求和得Y值作为综合指标，优选出SBE法最佳条件，这样更科学，更合理。

[1] 张兆旺，孙秀梅.试论“半仿生提取法”制备中药口服制剂[J].中国中药杂志，1995，20（11）：670-673.

[2] 张瑞亭，张兆旺，孙秀梅.思维方式的转换与中药“半仿生提取法”[J].中国中药杂志，1997，22（9）：542-544.

[3]张兆旺，孙秀梅.“半仿生提取法”的特点与应用[J].世界科学技术-中药现代化，2000，2（1）：35-38.

[4] 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].北京：化学工业出版社，2005：141-141.

Even-designed and optimized technology for semi-bionic extraction of Sophora Flavescens

WANG Ying-zi1，HUI Jian-Guo2,ZHANG Zhao-wang2,et al
(1.Beijing University of TCM,Beijing 100102,China;2.Shandong University of TCM,Jinan 250014,China)

[Objective]To optimize the technique of semi-bionic extraction(SBE)for Sophora Flavescens.[Methods]Based on the UL（91×33）even-design,matrine,oxymatrine,total alkaloids,total area of HPLC and dry extract were used as indexes to optimize the technology of SBE for Sophora Flavescens.[Results]The pH value of 3 times of extraction is 2.2008,7.4685 and 8.9890,respectively.The total extracting time is 3.9180 hours.[Conclusion]Based on the manufacture practice,the pH value of extraction of 3 times is 2.0,7.5 and 9.0,respectively and the extracting time is 2 hours,1 hour and 1 hour in turn.

Sophora Flavescens;semi-bionic extraction;even-design;multi-component indexes;comprehensive evaluation

R284.2

A

1672-1519(2010)01-0066-03

国家自然科学基金课题（30701110）。

王英姿（1975-），女，博士，副教授，主要研究方向为中药制剂新剂型与新技术。

2009-09-26）