紫草活性成分的分离制备研究

蔡兰芬 王宝杰 王洪波 翟 静 常维山

（①山东省畜牧兽医职业学院 潍坊 261061 ②济南深蓝动物保健品有限公司③泰山医学院 ④山东农业大学 泰安）

紫草活性成分的分离制备研究

蔡兰芬①王宝杰①王洪波②翟 静③常维山④*

（①山东省畜牧兽医职业学院 潍坊 261061 ②济南深蓝动物保健品有限公司③泰山医学院 ④山东农业大学 泰安）

本研究建立了高速逆流色谱分离制备紫草中的有效成分β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素和异丁酰紫草素的新方法，溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)，上相为固定相，下相为流动相。从150mg紫草的超临界提取物中制备得到17.6mg β-羟基异戊酰紫草素(纯度96.7%,)、17.6mg乙酰紫草素(纯度99.3%)和19.7mg异丁酰紫草素(纯度95.5%)。纯度经高效液相色谱分析，其化学结构由核磁共振1H NMR和13C NMR鉴定。

高速逆流色谱 紫草 成分 制备

*通讯作者

泰山紫草，为紫草属紫草科植物紫草Lithospermum erythorhizon sieb.et zucc.的根。紫草常被用来治疗烧伤、烫伤和各种皮肤病，其有效成分为各种蒽醌类物质。现代药理表明，紫草还具有具有抗炎、抗菌、抗病毒、及抗肿瘤的作用[1-11]。高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography， HSCCC)是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱新技术，目前已广泛应用于生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品及地质材料等领域。我国是最早开展HSCCC研究的国家之一，已利用HSCCC建立了多种中药有效成分的分离方法[12-18]。

本试验利用高速逆流色谱仪分离、纯化、制备了泰山紫草超临界萃物中的三种蒽醌类化合物：β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素和异丁酰紫草素。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料 TBE-300A高速逆流色谱仪(中国上海同田生化技术有限公司)；ÄKTA prime泵及检测系统(瑞士安玛西亚生物有限公司)；HX-1050恒温器(北京博医康实验仪器有限公司)；1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；色谱柱：SPHERIGELODS C18(250 mm×4. 6mm, .i d. 5μm)；Mercury plus400核磁共振仪(美国瓦里安公司)。泰山紫草药材采集自泰山，经专家鉴定为道地药材；用于粗提物的制备及HSCCC分离的溶剂均为分析纯(济南试剂总厂)；HPLC分析用甲醇为色谱纯(禹城化工厂)；实验用水为二次去离子水。

1.2 样品制备 紫草药材300克粉碎至颗粒60～80目。超临界萃取条件：萃取釜压力25MPa，温度45℃；分离釜的温度和压力分别为35℃和6 MPa ；CO2流量为40L/h，时间2.5h。

1.3 两相溶剂系统的制备及分配系数的测定 HSCCC溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，按比例配制于分液漏斗中并剧烈振荡，体系分相平衡后分离出上下相，分别超声脱气30min备用。分别取上相和下相各2ml，加入粗提物0.1mg，剧烈振荡5分钟后分别取上下相进液相色谱进行分析。目标组分在下相与上相中的浓度之比即为分配系数，根据分配系数选择合适的两相溶剂系统。

1.4 HSCCC分离过程：取150mg紫草粗提物，加入4ml上相，振荡使之完全溶解，以备HSCCC分离。将石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)的上相(固定相)与下相(流动相)以55:45的体积比泵入高速逆流色谱仪的螺旋管，待螺旋管完全充满后，以800r/min的速度旋转，同时以2.0 ml/min的流速泵入下相。分离温度由恒温器控制在20℃。当体系达到流体动力学平衡后，将样品由进样阀注入分离管路。柱后流出物以紫外检测器检测，检测波长为254 nm。根据色谱图手动收集各色谱峰组分。

1.5 HPLC分析及结构鉴定 紫草超临界提取物和HSCCC峰组分用HPLC进行分析。色谱柱：SPHERIGELODS C18 (250mm×4.6mm.id.5mm)；流动相：乙腈:水70:30，流速为1ml/min；检测波长：254nm；柱温：室温；进样量：20µl。

HSCCC各峰组分的结构根据1H NMR和13C NMR的数据进行鉴定。

2 结果

2.1 CO2超临界萃取收率 得到萃取物6.9g，萃取率为2.3%。

2.2 HPLC条件优化 研究了以甲醇-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-1%乙酸等作为HPLC流动相时，紫草超临界萃取物中各组分的分离效果。结果表明：当采用乙腈-水70:30，流动相流速为1ml/min时，可取得良好的分离效果。

2.3 HSCCC分离条件的优化 采用HPLC测定了目标组分在不同溶剂系统中的分配系数(表1、图1)。在本试验中，选用的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体系。采用体系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)时，紫草中的组分得到良好的分离。同时，对流动相流速、旋转管转速、分离温度等也进行了优化。结果发现：在流速为2ml/min，转速为800r/min，温度为20℃时，分离结果令人满意。

表1 各目标组分在石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体系中的分配系数

由表1可以看出，分离体系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)时，分配系数在0.92与3.03之间，属最佳分离体系。

图1 紫草粗提物的高速逆流色谱图

由图1可以看出，利用分离体系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)，可从紫草萃取物中分离出3种组分，即峰I、峰 II、峰III。

2.4 HSCCC峰组分的鉴定 利用核磁共振，根据1HNMR和13CNMR数据对HSCCC目标峰组分进行鉴定：按照参考文献[19], 峰I鉴定为β-羟基异戊酰紫草素；峰II鉴定为乙酰紫草素；按照参考文献[20]，峰III鉴定为异丁酰紫草素。

2.5 HSCCC分离纯化收率 在优化条件下，对紫草的超临界提取物进行了HSCCC分离纯化，从150 mg粗提物中可一次性得到17.6 mg β-羟基异戊酰紫草素、17.6mg乙酰紫草素和19.7 mg异丁酰紫草素.

3 讨论

乙酰紫草素等是紫草的主要有效成分[20]。本文建立了利用CO2超临界萃取泰山紫草有效物质的方法。萃取率可达2.3%。利用高速逆流色仪对泰山紫草蒽醌类活性成分进行了纯化制备，提纯了三种有效成分，经核磁共振分析，此三种成分分别是β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素和异丁酰紫草素。

据报道紫草对京科68-1病毒在体外有抑制作用，紫草素在鸡胚中能抑制流感病毒，在组织培养中能延缓脊髓灰质炎病毒的致细胞病变作用，紫草对乙型肝炎抗原(HBsAg)有抑制免疫反应作用；紫草对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌和绿脓杆菌有抑制作用；紫草的10%的生理盐水浸液对絮状表皮癣菌、羊毛状小芽胞癣菌等真菌有抑制作用。紫草水煎液对小白鼠结核病有一定疗效。杨荣[21]对软紫草、黄花软紫草、紫草、滇紫草、露蕊滇紫草、密花滇紫草6品种进行体外抑菌实验,表明：各紫草水、醇提液对金黄色葡萄球菌均有抑菌作用。赵清科等[22]人用炒紫草粉敷于疱疹上治疗带状疱疹总有效率97.4%，且愈后无感染及并发症。上述资料表明，泰山紫草是一种很有开发前景的抗感染中草药。

[1] BS Kaith, NS Kaith, and NS Chauhan (1996) J. Ethnopharmacol. 55:77-80.

[2] XC Weng, GQ Xiang, and AL Jiang (2000) Food Chem. 69:143-146.

[3] V Staniforth, SY Wang, LF Shyur, NS Yang (2004) J. Biol. Chem. 279:5877-5885.

[4] CC Shen, WJ Syu, SY Li, CH. Lin, GH Lee, CM Sun (2002) J. Nat. Prod. 65:1857-1862.

[5] K Sasaki, F Yoshizaki, H Abe (2000) Yakugaku Zasshi 120: 587-589

[6] K Sasaki, H Abe, F Yoshizaki (2002) Biol. Pharm. Bull. 25: 669-670.

[7] X Chen, L Yang, N Zhang, JA Turpin, RW Buckheit, C Osterling, JJ Oppenheim, OMZ Howard (2003) Antimicrob. Agents Chemother. 47: 2810-2816.

[8] K Yamasaki, T Otake, H Mori, M Morimoto, N Ueba, Y Kurokawa, K Shiota, T Yuge (1993) Yakugaku Zasshi 113: 818-824

[9] YJ You, Y Kim, GY Song, BZ Ahn (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2301-2303.

[10] Y Masuda, G Shima, T Aiuchi, M Horie, K Hori, S Nakajo, S Kajimoto, T Shibayama-Imazu, K Nakaya (2004) J. Biol. Chem. 279: 42503-42515.

[11] GJ Kapadia, V Balasubramanian, H Tokuda, T Konoshima, M Takasaki, J Koyama, K Tagahaya, H Nishino(1997)Cancer Lett. 113:47-53.

[12] GB Lim, SY Lee, EK Lee, SJ Haam, WS Kim (2002) Biochem. Eng. J. 11:181-187

[13] N Aghel, Y Yamini, A Hadjiakhoondi, SM Pourmortazavi (2004) Talanta 62: 407-411.

[14] MCD Maroto, MSP Coello, MD Cabezyllo (2002) J. Chromatogr. A 947: 23-29.

[15] X Wang, YQ Wang, YL Geng, FW Li, CC Zheng (2004) J. Chromatogr. A 1036: 171-175.

[16] Y Jiang, HT Lu, F Chen (2004) J. Chromatogr. A 1033: 183-186.

[17] Y Wei, TY Zhang, GQ Xu, Y Ito (2001) J. Chromatogr. A 929: 169-173.

[18] L Lei, FQ Yang, TY Zhang, PF Tu, LJ Wu, Y Ito (2001) J. Chromatogr. A 912: 181-185.

[19] XR Cui, M Tsukada, N Suzuki, T Shimamura, L Gao, J Koyanagi, F Komada, S Saito (2008) Eur. J. Med. Chem. 43: 1206-1215.

[20]A.Y.Zhang. Studies on the constituents from Arnebia euchroma(Royle).Johnst andLithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc.and the preparation of ZiCao scalding ointment. masters dissertation from Shenyang Medical University: 23.

[21] 葛锋, 王晓东, 王玉春. 药用紫草的研究进展[J], 中草药, 2009, 34(9): 附7-9.

[22] 赵清科, 赵玉强. 紫草粉治疗带状疱疹38例, 实用中医药[J], 1999, 15(4): 30-31.

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