杏丁注射液对顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用及其机制

陈军宁,温海滨,谭 宁

(1桂林医学院附属医院,广西桂林 541001;2桂林医学院科学实验中心)

杏丁注射液是银杏叶提取物(EGb)的复方制剂,主要成分为银杏总黄酮,对心、脑和肠等组织器官缺血再灌注损伤有明显的保护作用。顺铂是临床常用的化疗药物,但其严重的肾毒性限制了其临床应用。新近研究表明,顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡在其肾毒性中发挥重要作用[1]。2008年 9月～2009年 12月,我们采用肾小管上皮细胞株NRK52E进行体外培养,观察杏丁注射液对顺铂肾毒性的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与分组 肾小管上皮细胞株NRK52E购自中科院上海细胞库,DMEM培养液、小牛血清(GIBICOL公司),CCK-8试剂(大连宝生物有限公司),RT-PCR反应体系(Promega公司),Casepase-3 mRNA引物由上海赛百盛生物技术有限责任公司合成,杏丁注射液(贵州益佰公司),顺铂(云南个旧生物有限公司)。实验分为阴性对照组、2μg/ml、4 μg/m l、8μg/m l三种浓度顺铂组、顺铂+杏丁(4 μg/m l)组。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NRK52E细胞置于含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/m l链霉素的DMEM培养液中,37℃、5%CO2培养箱中传代培养。每 2 d换液 1次,4 d传代。

1.2.2 细胞增殖测定(CCK-8法) 取对数生长期NRK52E细胞,待生长至近融合状态,加入含0.25% EDTA的PBS消化,接种于96孔板,置CO2培养箱培养 24 h后加入药物,在培养箱中继续培养 24、48、72、96、120、144、168 h加入10μl CCK-8混合液,振荡10 s继续培养2 h后吸出上清液,上流式细胞仪于450 nm处测OD值(A值),细胞存活率的计算公式：细胞存活率 =实验组 A值/对照组 A值 × 100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 用含 10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度为1×106/ ml,置5%CO2、37℃培养箱中培养 12 h后,用含0.5%小牛血清的DMEM培养液继续培养24 h。各实验组加入药物,对照组不加药,分别作用 24 h后收集贴壁细胞,制成单细胞悬液,70%乙醇固定,4℃保存过夜,-20℃保存。检测前用PBS洗去固定液,加入20μl RnaseA,37℃孵育,加入PI染液,调整细胞浓度为 1×105～1×106/ml,上流式细胞仪检测,激发波长488 nm,用Multicycle DNA分析软件测定细胞凋亡。

1.2.4 RT-PCR检测Survivin mRNA水平 取NRK52E细胞加入药物后作用24 h后TRIzol一步法提取总RNA,取1μl总RNA以10μl体系逆转录,制备cDNA,并稀释30倍备用。Caspase-3 mRNA上游引物：5′-TGACCGAGGCTACATTCAGATGACACC-3′,下游引物：5′-CAAGAGAGTTGGGCTGACCAGAAACAC-3′,扩增产物365 bp;β-action上游引物：5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3′,下游引物：5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′,扩增产物243 bp。扩增后取扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0软件进行数据处理,结果以±s表示,组间比较采用两两比较的 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测细胞生长结果 以 2、4、8 μg/m l顺铂分别干预NRK52E细胞,结果显示顺铂对NRK52E细胞有明显的细胞毒性作用,随顺铂浓度增加细胞存活率逐渐下降,呈明显的剂量依赖关系(P＜0.05)。见图1。杏丁预处理24 h后再加入顺铂,结果显示,杏丁能显著降低顺铂对NRK52E细胞生长的抑制作用(P＜0.05)。

图1 杏丁对顺铂致NRK 52E细胞毒性的影响

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 随着顺铂浓度的增加,G0/G1期细胞明显减少,G2/M期及 S期细胞明显增多,细胞凋亡率明显上升(P＜0.05)。杏丁预处理 24 h后再加入顺铂,细胞凋亡率明显下降(P＜0.05)。

表1 杏丁对顺铂致NRK 52E细胞凋亡的影响(%)

2.4 RT-PCR检测结果 RT-PCR检测结果显示,杏丁可明显抑制Caspase-3的表达上调。见图2、图3。

图2 顺铂致NRK 52E细胞Casepase-3m RNA的表达

图3 杏丁联合顺铂对NRK 52E细胞Casepase-3mRNA表达的影响

3 讨论

顺铂是广谱抗肿瘤药,其疗效与剂量成正比。但顺铂是细胞周期非特异性药物,无明确的靶向组织,故毒副作用也较多。肾毒性是顺铂常见且影响较大的毒副作用之一,其发生率和损伤程度与顺铂的剂量呈正比,随顺铂剂量增加而加重。在Caspase依赖型凋亡途径中,细胞凋亡途径可分为线粒体途径(内源性)、死亡受体途径(外源性)以及内质网途径。研究发现,顺铂引起的肾小管上皮细胞凋亡是通过线粒体途径和死亡受体途径完成的[2]。在线粒体途径中,线粒体不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心,而且是细胞凋亡调控中心和细胞生命活动控制中心。研究表明,细胞色素 C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。死亡受体途径由Fas与FasL结合,从而启动凋亡信号。Park等[3]研究发现,在顺铂诱导LLC-PK1细胞发生凋亡的过程中,顺铂能诱导Bax分子的激活,进而使细胞线粒体膜的通透性增加,细胞色素 C从线粒体释放增加,并激活Casepase-9,进而启动内源性细胞凋亡途径。Tsuruya等[4]在体内和体外研究均发现Fas-FasL及TNF-TNFR1途径参与了顺铂诱导的细胞凋亡。

药理研究表明,EGB具有抗氧化、清除自由基、抑制LDL氧化修饰、保护血管内皮细胞的功能。近年来,随着研究的深入,EGB在细胞凋亡中的作用也渐渐受到重视。Xin等[5]认为,EGb可能通过上调Bcl-2、下调Bax、改变Bcl-2/Bax比值来抑制神经细胞凋亡,对脑缺血再灌注损伤起保护作用,缩小脑梗死体积。Smith等[6]的实验表明,EGB能上调PC12细胞的Bcl-2表达,抑制Caspase-3激活,下调Caspase-12,减少细胞色素C释放和DNA断裂,从而减少细胞凋亡。王琳等[7]报道,EGB能抑制TNF-α诱导的人肾小管上皮细胞凋亡。本实验结果显示,肾小管上皮细胞经顺铂诱导后细胞凋亡数明显增多,而杏丁注射液能明显减少肾小管上皮细胞凋亡,且Casepase-3 mRNA表达显著降低,说明杏丁注射液可能通过抑制肾小管上皮细胞Casepase-3表达从而抑制细胞凋亡,继而对肾小管上皮细胞起到保护作用。这一研究结果不仅有助于进一步了解顺铂致肾损伤的发生机制,而且对寻求药物作用靶向治疗具有指导意义,为临床防治顺铂致肾损伤提供了理论依据。

[1]Okuda M,MasakiK,Fukatsu S,et al.Role of apoptosis in cisplatin-induced toxicity in the renalepithelialcell line LLC-PK 1.Implication of the functions of apical membranes[J].Biochem Pharmacol,2000,59(2)：195-201.

[2]Wang X.The expanding of m itochondria in apoptosis[J].Genes Dev,2001,15(22)：2922-2933.

[3]Park MS,De Leon M,Devarajan P.Cisplatin induces apoptosis in LLC-PK 1 cells via activation ofmitochondrial pathways[J].JAm Soc Nephrol,2002,13(4)：858-865.

[4]Tsuruya K,Tokumoto M,Ninom iya T,et al.Antioxidant ameliorates cisplatin-induced renal tubular cell death through inhibition of death receptor-mediated pathways[J].Am J Physilo,2003,285 (2)：208-218.

[5]XinW,WeiT,Chen C,etal.Mechanismsofapoptosis in rat cerebellar granule cells induced by hydroxyl radicals and the effects of EGb761 and its constituents[J].Toxicology,2000,148(2-3)：103-110.

[6]Smith JV,Burdick AJ,Golik P,et al.Amti-apoptotic properties of Ginkgo biloba extract EGb 761 in differentiated PC12 cells[J].Cell Mol Biol,2002,48(6)：699-707.

[7]王琳,徐西振,凃玲.银杏叶提取物抗肿瘤坏死因子-α诱导的人肾小管上皮细胞凋亡及机制[J].华中科技大学学报,2008, 37(2)：181-184.