不同功效中药诱导间充质干细胞定向分化的研究概况

2010-02-18杨万章金明月

中西医结合心脑血管病杂志 2010年2期

戴映,杨万章,金明月

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有分化成间质起源的任意组织的潜能,包括向神经元样细胞、软骨、脂肪、造血基质及骨等分化成熟的特征[1,2]。MSCs不仅存在于骨髓中,也可从脐血、外周血中以及脂肪组织、肌肉、胎儿器官、大脑、牙齿中分离,也有人从脐带静脉内皮下层分离出MSCs[3]。由于MSCs向神经细胞等多种细胞分化的特性及其特有的免疫调节特性[4,5],故而成为目前研究的热点,使其作为最佳种子细胞在组织工程中令人看好。人们把间充质干细胞可以跨系,甚至跨胚层分化这一特性称为干细胞的可塑性(p lasticity),也称为横向分化(transdifferentiation)[6]。利用这一特性在体外大量诱导分化成神经细胞后,可作为治疗神经系统损伤疾病的种子细胞来源。中医药学对神经功能缺损疾病的治疗也有着比较深刻的认识和丰富的经验,近年研究表明,中药不仅可以保护神经细胞,提高神经元抵抗损伤的能力,而且还可以促进MSCs增殖并诱导其定向分化为神经元样细胞,达到治疗神经功能缺损疾病的目的。现依据不同功效的中药对间充质干细胞定向诱导为神经元样细胞的思路,将近几年有关的实验研究情况简单的综述如下。

1 补中益气药诱导间充质干细胞分化

中国传统中药的应用历史源远流长,黄芪、人参等更是临床应用较多的中药。黄芪、人参益气活血、抗氧化、延缓衰老、增强机体免疫功能等作用,实验同样证明对正常大鼠的学习、记忆过程有促进作用。贾延劼[7]首次采用黄芩苷诱导大鼠MCS(rMSC)在体外分化成为神经细胞,多数细胞表达神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF),黄芩苷与巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)相比,虽然在早期诱导效果不如β-ME,但是长期效果优于β-ME,且细胞存活率较高。刘金宝等[8-10]采用多种单味中药(当归、人参、天麻、黄芪等)诱导rMSC,1 h～3 h后,其中大部分rMSC分化为神经元样细胞,其转化率分别为当归(74.2±3.8)%、人参(69.3±4.1)%、天麻(75.3±4.1)%、黄芪(93.7±2.3)%。姚晓黎等[11]报道参芪液(含党参和黄芪)可在体外诱导人MCS(hM SC)分化为神经元样细胞。参芪液具有补中益气、生津养血的功效,可以促进正常机体生长,有抗氧化、增强免疫和抑制细菌的作用。

2 补肾填精药诱导间充质干细胞分化

刘柏炎等[12]认为干细胞可归于中医正气范畴,胚胎干细胞与先天之精气有关。中医学的“精”在内涵上与干细胞有很大的相关性,干细胞具先天之精属性,是先天之精在细胞层次的存在形式。肾藏精,精生髓,脑为髓之海。根据干细胞具先天之精属性理论及精生髓通脑理论,张进等[13]认为,来自骨髓的MSC与中枢神经系统的NSC同属先天之精,它们能相互转化,而且MSC可能更是参与了中枢神经系统内的正常细胞更新,补肾填精法可能会对这种MSC向神经元样细胞的分化起促进作用。他们采用龟板水煎液体外诱导rMSC分化为神经元样细胞。陈东风等[14]报道rMSC经龟板含药血清体外诱导后分化的神经元样细胞神经丝蛋白表达阳性,诱导12 h后,神经元样细胞阳性率达到高峰,细胞存活时间较长,至第7天仍有神经元样细胞存活。邝学媚等[15]报道三甲复脉汤含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化也有类似发现,而且其中以三甲复脉汤中细胞存活时间最长。

3 活血补血药诱导间充质干细胞分化

当归、丹参、三七、川芎等中药具有活血补血、抗氧化等作用。近年来,随着严善福等[16]发现牛膝多糖体外能促进MSC增值,更多的研究集中在活血补血中药成分可体外诱导MSC向神经元样细胞的分化上。孟凡刚等[17]用丹参诱导成年小鼠骨髓基质干细胞,分别于诱导后5 h、24 h、72 h进行免疫细胞化学染色,结果显示巢蛋白(Nestin)和βⅢ-微管蛋白(βⅢ-Tubulin)均呈阳性表达。冯亚波等[18]分别采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和丹参注射液联合或2-巯基乙醇(2-ME)单种诱导骨髓间质干细胞(rMSCs),免疫组化鉴定NSE、NF、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果显示在体外用丹参注射液与bFGF联合诱导可以使成年Wistar大鼠rMSCs分化为神经元样细胞,并且存活时间明显延长。余勤等[19]采用含丹参注射液的无血清Dulbecco改良Eagle培养基(DM EM)/F-12培养液诱导大鼠rMSCs分化为神经元样细胞,通过观察rMSCs经诱导后细胞的形态变化和采用免疫组化方法检测神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经丝蛋白(NFM)、GFAP的表达来鉴定神经元样细胞。发现丹参注射液可以在体外诱导rMSCs分化为神经元样细胞,其诱导分化率与丹参注射液的浓度有关。丹参能够诱导骨髓间充质细胞向神经元分化的机制目前还不清楚,推测可能是丹参对处于活性氧应激状态的细胞有保护作用,丹参注射液中的三种水溶性成分对维生素C2NADPH系统及Fe2+半胱氨酸系统诱发的脑微粒体脂质过氧化有很强的抑制作用,能够清除氧自由基,这些可能是其对神经细胞产生保护作用的机制。

复方活血补血方剂及丹参的有效成分丹参酮都与丹参一样,其具有的抗氧化作用可能与其定向诱导机制有关。武衡等[20]应用血清药理学方法证实,脑溢安(钩藤、生地黄、牡丹皮、三七、地龙等)含药血清具有促进大鼠海马MSC向神经元方向分化的作用,提高NSC分化为神经元的比率,此外尚具有促进神经细胞存活的作用。并认为脑溢安通过影响MSC的增殖、分化、移行来促进神经元再生、提高神经功能恢复水平。黄慧等[21]用香丹注射液(含丹参和降香)定向诱导大鼠MSC分化为神经元样细胞,推测丹参的水溶性成分丹参素的抗氧化作用可能是产生定向诱导的主要原因之一。其可能机制是丹参素能抑制环核甘酸磷酸二酯酶的活力,提高胞内环核甘酸(cAMP)水平,后者进一步激活蛋白激酶A(p rotein kinase A,PKA)、p38ER K 1ö2等信号传导,最终引起神经突起发生和延长。另外,丹参素也可能通过刺激MSC产生白细胞介素而诱导或参与MSC定向分化为神经元样细胞。夏文杰等[22]选用第5代、第10代的MSC以bFGF预诱导,再用丹参酮ⅡA和隐丹参酮诱导,发现大部分M SC可转变为神经元样细胞,并有轴突和树突出现,多个神经元之间可形成网络。前者诱导的神经细胞表达NSE、NFM,提示该细胞可能尚处于神经元前体细胞阶段;后者诱导的神经细胞表达NSE、高分子量神经丝蛋白(neurofilament-H,NF-H),提示神经元趋向成熟,并推测两者的诱导机制可能与其抗氧化作用有关。

4 芳香药诱导间充质干细胞分化

中药中走窜开窍的芳香类药物(如含麝香陈芬的药物)也能体外诱导MSC向神经元样细胞分化。肖庆忠等[23,24]用含麝香多肽(musk polypeptide,Mu-p)或麝香酮(muscone,M u-n)的培养基体外定向诱导第5代～10代rMSC,结果发现细胞突起伸出,形似神经元,免疫组化同样显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF、巢蛋白表达阳性,GFAP阴性。神经元样细胞计数分析发现MSC经Mu-p诱导后,NSE和NF-H阳性细胞的比例分别高93.5%和88.2%。而含Mu-n的培养基却无上述变化。表明Mu-p能在体外诱导rMSC定向分化为神经元样细胞,而Mu-n却无此能力。研究中所诱导得到的神经元样细胞可在体外存活时间较长(7 d后仍有约10%的神经元存活)。同时应用所获得的神经细胞进行了大鼠脊髓横断性损伤和大鼠帕金森病的细胞替代治疗发现其可重建相应的神经功能,证明其在体内发挥了相应的神经细胞功能,因此推测研究中所获得的神经元样细胞极有可能是有功能的神经元。Mu-p的诱导机制可能与其对神经细胞生长分化和突起生长的调节作用以及其具有抗氧化、抗损伤作用有关。黄洁等[25]采用血清药理学方法,从体外实验证实牛珀至宝微丸含药血清体外诱导成年大鼠MSC分化为神经元。牛珀至宝微丸系由中医急症三宝之一的至宝丹化裁而来,主要药物为水牛角、玳瑁、麝香、琥珀、血竭、藏红花、大黄、石菖蒲等。

5 小结与展望

MSCs体外诱导向神经细胞分化,国外研究较多使用的是2-硫基乙醇、二甲亚砜、硫代甘油等作为诱导剂,但这些化学制剂均有一定毒性,不适宜应用于人体内,利用经临床验证的传统中药作为诱导剂,具有价廉、安全等优点,可望成为今后临床神经细胞移植安全有效的诱导分化剂。但中药诱导MSCs向神经元样细胞分化研究中,尚有许多问题有待解决。如有关中药诱导剂的研究并没有报道其对MSCs诱导后的存活率情况,只是报道了诱导出的细胞表达了神经元的标志;而且大部分研究都没有对诱导后细胞的功能进行检测,能否有效的刺激宿主细胞分泌神经营养因子,促进神经损伤功能的恢复都需要进一步研究。虽然目前使用中药诱导干细胞定向分化的研究工作才刚刚起步,其诱导机制也有待进一步深入研究。但中药诱导干细胞定向分化技术无疑将推动医学界一场新的革命,推动中医药要走向世界,走向现代化。

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