姜黄素对血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠心肌细胞细胞外信号调节激酶表达的影响

郭炳彦,石英辉,韩 瑞,韩德荣,李拥军

心肌肥大是以心肌体积增加和蛋白质含量增多为主要特征的生长异常,是引起多种心血管疾病的危险因素之一。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)与多种生长因子均可促使心肌肥大的发生和发展,细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在其中起着关键作用[1]。姜黄素是植物姜黄的主要成分,其药理学研究已有百年历史,姜黄素具有抗炎、抗氧化、降血脂和抗动脉粥样硬化等多种药理作用[2-4],临床上可用于冠心病的治疗。但其对心肌肥大的作用报道较少。本实验用体外培养的新生大鼠心肌细胞研究姜黄素对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大及ERK表达的影响,探讨姜黄素此作用的可能机制,为其在临床用于防治心肌肥大提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 出生1 d～3 d Sprague-Dawley大鼠,河北医科大学实验动物中心提供,清洁级,质量许可证号:SCXK(冀)2008-1-003,雌雄不限;DMEM培养基(Gibco公司,美国),AngⅡ(Sigma公司,美国),胰蛋白酶(Sigma公司,美国),胶原酶Ⅱ(Invitrogen公司,美国),ERK1/2抗体(购自武汉博士德公司),姜黄素(北京博奥森生物技术有限公司生产,纯度大于 95.5%),其他试剂为分析纯产品。

1.2 新生大鼠心肌细胞培养 取1 d～3 d新生Sprague-Dawley大鼠,在超净工作台上常规手术取心室肌组织,用4℃D-Hanks液洗净残血,将心室肌剪碎,用0.1%胰蛋白酶加0.04%胶原酶Ⅱ连续消化成单细胞悬液,所有心肌细胞原液经200钼细胞筛过滤,差速贴壁1.5 h,将未贴壁的心肌细胞用含10%胎牛血清及青霉素、链霉素DMEM培养液稀释成1×108/L,并加入0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌细胞增殖,然后将细胞均匀地接种于 6孔培养板,每孔2 mL,置于37℃、5%CO2培养箱中培养2 d,然后换无血清培养液。

1.3 实验分组 乳鼠心肌细胞于无血清DM EM继续培养24 h后,分成 3组,对照组、AngⅡ组(10-6mol/L)、姜黄素组(AngⅡ10-6mol/L+姜黄素2.5×10-8g/L)。

1.4 心肌细胞蛋白合成速率测定 心肌细胞在无血清培养液中培养24 h后,加入各种干预因素和18.3 kBq[3H]-亮氨酸继续培养 24 h。弃培养液,PBS冲洗3遍,用 0.1%胰蛋白酶消化后收集细胞于玻璃纤维素膜上,用10%的三氯乙酸固定,滤膜烘干后用LS-3810液体闪烁仪测定掺入量。

1.5 心肌细胞蛋白的提取 终止细胞培养,将培养板中的培养液吸出,用预冷PBS洗培养物3次,弃去PBS。用细胞刮棒刮培养孔底部,将贴壁细胞刮下来用冰PBS收集以1 500 r/min～3 000 r/min离心6 min～10 min,去上清。向沉淀加入心肌细胞裂解液100 μ L和 PMSF 1μL,冰上裂解30 min,每10 min吹打一次。12 000 r/min离心15 min,移上清于1 mL的EP管中,-80℃冰箱保存。

1.6 免疫印迹法(Western blot)检测ERK1/2蛋白表达 用Bio-Rad的蛋白定量试剂盒测蛋白浓度,完毕后将之加入5×SDS加样缓冲液中煮沸5min,以使蛋白质样品变性,然后置于-80℃冻存备用。用12%十二磺基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白,用电转移方式将蛋白转移至硝酸纤维膜上,用含5%脱脂奶粉的 TBST封闭1 h,加入一抗(1∶1 000),4℃过夜,次日用 TBST洗 3次后,加入二抗(1∶2 000),孵育1 h,TBST洗3次,ECL发光,压胶片曝光,对所得条带进行扫描。

1.7 统计学处理 应用SPSS 11.0软件,数据以均数±标准差(±s)表示,采用One-Way ANOVA进行统计分析,两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1 各组心肌细胞蛋白合成速率 AngⅡ组(2 282.32 cpm±245.48 cpm)较对照组(1 313.64 cpm±202.58 cpm)显著增加(P＜0.01),姜黄素组(1 761.62 cpm±212.44 cpm)较 AngⅡ组显著降低(q=48.42,P＜0.01)。

2.2 各组心肌细胞 ERK1/2的表达 AngⅡ组ERK1/2(456.5±8 3.3)表达较对照组显著增加(190.5±25.3,θ=35.14,P＜0.01),而姜黄素组较AngⅡ组显著降低(216.2±19.6,θ=19.64,P＜0.01)。

3 讨 论

血管紧张素Ⅱ作为一个重要的神经内分泌因子,不仅能够控制心血管系统的生理功能,对心肌肥大或心力衰竭的病理生理过程也能起到至关重要的作用。MAPK通路是一条重要的胞内信号转导通路,参与AngⅡ诱导的心肌肥大反应[5]。它主要包括ERK、应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase,SAPK/JNK)、p38MAPK 3种;ERK途径是细胞生长、分化与存活等过程的重要信号转导机制,其中ERK1/2与心肌细胞肥大关系最为密切[6],ERK主要由Raf通过Ras激活,磷酸化ERK是其活化形式。其活化后转位到核内,作用于下游的转录因子 ELK、AP-1、NF-κ B等,调节引起心肌肥大相关的基因(如c-fos、c-myc、c-jun)的转录。研究发现AngⅡ可诱导ERK磷酸化,从而活化ERK通路引起心肌肥大反应的发生。延缓由细胞外信号引起的肥大进程是任何控制肥大的治疗措施的关键[7]。姜黄素是从植物姜黄、郁金、莪术等植物根茎中提取的一种生物多酚化合物。具有行气破血、消积止痛、清心解郁等功效。具有抗氧化和清除自由基、抗血小板、调节血脂、抗动脉粥样硬化、抗炎、抑制血栓形成等广泛的药理作用,并且具有肝脏及肾脏保护功能,毒副反应小。姜黄素还可改善压力超负荷兔的心功能[8]。因而推测姜黄素在治疗心力衰竭等心血管疾病方面有着广泛的应用前景。

本研究结果显示,AngⅡ可显著增加新生大鼠心肌细胞蛋白合成速率,而姜黄素可显著抑制心肌细胞蛋白合成速率,说明姜黄素可抑制AngⅡ所致的心肌细胞肥大。AngⅡ可显著增加心肌细胞ERK1/2的表达,姜黄素使ERK1/2表达显著降低,说明姜黄素可能通过降低胞内信号转导分子ERK1/2的表达,实现防止心肌细胞肥大的作用。下一步研究要着重于姜黄素对ERK信号通路的上下游分子的影响,进一步阐明姜黄素抗心肌肥厚的机制,为其在临床用于心肌肥厚的防治提供实验依据。

姜黄素可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞核内信息分子ERK1/2的表达,这可能是姜黄素抗心肌肥大的重要机制之一。

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