生物反应器在血管组织工程中的应用及进展

李春民 汪忠镐2*

（首都医科大学附属复兴医院血管外科，北京 100038）2（首都医科大学宣武医院血管外科，北京100053）

引言

血管组织工程是一门交叉学科，以细胞生物学和工程学为基础，利用生命科学和工程学原理，用细胞培养技术在体外模拟构建机体血管的技术，其目的是为患者提供血管替代物［1］。血管组织工程的基本思路为：将体外分离、培养的自体血管组织细胞，种植于具有良好生物相容性并可最终完全降解的生物材料上，形成细胞生物材料复合体，植入体内与宿主血管组织融合生长，重塑后完全演变为自体正常血管。种子细胞和支架是构成组织工程的核心：种子细胞能够新生血管组织，而且不会引起机体免疫排斥反应；血管支架是活细胞在体外生长所需的支持物，提供一个细胞生长的三维空间，便于细胞附着、生长及迁移，同时也是构建血管所需的骨架结构。由于组织工程能完全恢复血管组织结构和功能，使该技术成为最理想的修复重建手段，因此是近年来血管外科研究的新方向和热点［2-3］。

早在1986年，Weinberg把牛主动脉的内皮细胞（ECs）、平滑肌细胞（SMCs）和外膜的成纤维细胞种植于胶原构建的支架内，最先构建出3层的动脉血管结构，该血管的爆破强度仅为90 mmHg，远低于自然血管［4］。导致这种情况的主要原因是没有能够得到一个类似于生物体内具有机械、生物化学等生理刺激的环境，这使得研究者开始着手研制生物反应器。作为血管组织工程构建的关键要素之一，血管组织工程生物反应器是在体外造就一个与体内相似的环境，形成加速血管种子细胞培养、血管组织构建的系统。生物反应器的发展为组织工程的发展提供了载体，在生物反应器内进行血管三维构建和培养已成为目前血管组织工程常用、有效的方式。

1 生物反应器的种类

近年来，组织工程用生物反应器飞速发展，种类也越来越多，先后出现了搅拌式生物反应器，气升式生物反应器、中空纤维式生物反应器、单轴和双轴旋转壁式生物反应器等。旋转壁式生物反应器（rotating wall vessel bioreactor，RWVB）的出现是反应器发展的一个里程碑，它是1990年由Kleis等首先研发成功［5］，随后于1992年被美国航空航天局（NASA）应用，作为在地面上模拟微重力条件下细胞生长的一种新型细胞及组织培养装置，目前主要应用于骨、软骨、心血管等领域。RWVB的主体一般由内外同心圆柱组成，内柱由可以进行气体交换的半透膜构成，内外柱之间充满培养基和预先种植了细胞的支架。由于它具有动态培养环境的优势，被广泛应用于血管组织工程领域，并在它出现后的十几年里得到了非常快的发展，出现了许多新改进的反应器类型。

一个理想的生物反应器应具备健全的可以控制的环境因素［6］：pH、O2、温度、营养物质的传送和代谢废物的排出等，同时还要做到无菌和自动化控制。在生物反应器的设计中，对于要培养的细胞或组织来说，生物力学和生物化学的调控是模拟生理环境最需要的。流体力学的应力（即剪切应力）是最重要的生物反应的机械刺激信号，常被广泛应用于生物反应器的机械刺激方面。作为生物反应器，应至少能够具有以下5种功能中的一种：一是能够在三维支架上建立均匀分布的细胞层；二是在培养的介质中能维持恒定的气体和营养物质的供给；三是给生长提供有效的物质传递；四是培养中的组织能够受到生理的刺激；五是能提供三维培养组织的生长信息，而最初步的信息来自于独立培养的细胞［7］。

2 生物反应器与种子细胞的培养、扩增

血流动力学影响生物体内的动脉搏动产生血流，对血管壁造成以下两种机械应力：一种是由血流冲击造成的平行血流长轴的剪切应力，主要影响内皮细胞的排列和功能；另一种是由血流压力形成的沿管径分布的环形张力，主要影响平滑肌细胞的排列和功能状况。

细胞在运行的生物反应器内，可以受到流体剪切应力的作用。拟胚体在生物反应器内的培养需要一个最佳的剪切应力，比较低的剪切应力容易使拟胚体聚集，而过高的剪切应力则导致细胞死亡。已观察到在较低剪切应力的反应器内可以加速拟胚体的聚集。不同的干细胞有其最佳的剪切应力，上皮干细胞的培养最适合的剪切应力为0.21 Pa，而胚胎干细胞最适合的为 0.61 Pa，在0.45 Pa压力下，细胞就发生了聚集［8］。Chen同时发现，20 r/m的转速可以防止细胞在反应器内聚集［9］，8 d后细胞开始在旋转反应器内聚集。所以有学者认为，微重力条件仅有一个较短的时间适合于高质量的干细胞扩增［10］。在培养过程中，应用70 μm的过滤器或通过反复移液吹打的方法分离聚集的细胞，但在13 d后这些方法也无作用，因为反应器内的细胞发生了严重的聚集。所以，在第8 d细胞数量达到顶峰，随后开始下降。由此可见，应该选择8 d作为细胞在反应器内扩增的平均时间。

Sanford在对牛主动脉内皮细胞的培养中，发现经过在生物反应器内30 d的三维培养，扫描电镜结果显示，细胞具有典型的内皮细胞形态，在细胞数量和迁移功能方面，明显高于对照组［11］。同时发现，三维培养的内皮细胞分泌的NO比对照组高10倍，而且反应器的旋转速度不同，分泌的NO增加量也有明显不同：在8 r/min条件下较对照组增加73％，在20 r/min条件下则增加500％。这充分说明机械刺激信号对内皮细胞生长有显著作用。

在静态条件下，间充质细胞（mesenchume cells，MSCs）进行扩增需要耗费较长的时间，不适于临床的应用，人们转而寻求另一种能够快速扩增的方法。Chen在对人成体间充质干细胞研究中发现，在生物反应器内的MSCs可以扩增29倍；同时通过细胞表型分析和功能检验发现，扩增后的MSCs仍保持其原有的生物特性［10］。MSCs在体外能支持造血功能，在过去的研究中，MSCs细胞与造血干细胞（haemopoietic stem cells，HSCs）在反应器内共同培养，能够保持其多向分化的能力。这种混合培养体系对于MSCs和HSCs生长都是有利的，因为悬浮液系统在体外模拟了骨髓微环境，其中包含生长所需要的各种要素细胞因子、化学激素、生长因子等。三维旋转式生物反应器是目前最理想的培养体系，它提供了独特的生长环境，使剪切应力降到最低，实现微重力的环境，特别适合于哺乳动物细胞的生长。生物反应器内扩增MSCs可以完全表达MSCs原始的细胞标记，同时维持高水平的 CFE-F/day（colony-forming efficiency-fibroblast per day），而且能保持在合适诱导条件下向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞分化的能力。许多研究证明，MSCs细胞与HSCs在旋转反应器中共同培养，可以使MSCs得到迅速的扩增［12-13］。

在生物反应器中，有3个条件对细胞产生重要的影响：营养方式、剪切应力、培养基的补充。有限稀释法［14-16］（LDF）在目前的研究中发现有许多的优势：首先，在培养体系中，干细胞的快速扩增可导致有刺激作用的细胞因子减少，使培养系统中有害因子增加，这将阻碍初级的干细胞进一步扩增。通过LDF，可以稀释培养基中的抑制因子，同时保留有刺激因素的因子。其次，为了在体外获得最佳的细胞扩增，对反应器系统进行营养物质和代谢废物交换，可以等同于体内环境。每天交换悬浮培养体现20％的培养基，可以完全模拟血浆在骨髓内的灌注（大约每分钟0.1 mL/mL骨髓）。现在的研究证实每天20％的稀释培养完全可以适应于MSCs快速扩增的需要。

生物反应器对干细胞来说，不仅仅局限于进行细胞数量的扩增，更重要的是对干细胞的培养环境进行监测和调控。生物反应器内的调控不是简单地维持干细胞环境持续的恒定，而是能长时间动态地供应细胞营养、氧和生长因子等，这会改变目前干细胞培养的现状［17］。另外，在反应器内创造一个呈梯度分布的培养环境也是必要的，可使一些生长环境不同的细胞分布在同一个反应器内的不同区域，这些细胞间能产生相互影响。选择生物反应器要根据细胞的种类、生长方式，反应器的调控方式也很重要。目前如何保持干细胞多向分化的潜能，是制约生物反应器内大规模培养扩增的一个障碍［18］。

未来的问题是寻找出适合各种干细胞培养的条件，同时建立适应于大规模细胞扩增的培养体系。灌注法与持续供给营养的优点在最近的研究中已被证实，但理想的培养条件和参数需要进一步确定。PO2、pH、温度和营养物的浓度等已经在静态培养中得到确定，而在可以受到严格控制和调节的生物反应器内的培养仍需要摸索出一个最佳的参数和条件。另外，值得注意的是，理想的参数值因为干细胞种类的不同而不一致；同时，不同干细胞的扩增、分化所需要的参数也是不同的。剪切应力对多种干细胞的影响已被研究，但需要更深入地研究在反应器环境中的影响［19-20］。

3 生物反应器在组织工程血管构建中的应用

现在，许多研究集中在生物反应器内进行两次细胞种植，即模拟自然血管分别种植平滑肌细胞和内皮细胞［21-23］。作为组织工程血管支架的细胞外基质成分容易获得，也能够构建成血管支架，但以下工作却是要在生物反应器内实现，比较耗费时间。首先，要在支架中层种植平滑肌细胞，使其分泌细胞外基质，以形成纤维型的胶原；其次，还要种植内皮细胞，并确保内皮细胞层能在支架内壁融合，以实现耐受 20 dyn/cm2的机械剪切应力。Isenberg［23］应用纤维素凝胶，需要 5周时间才能构建成血管支架，种植的内皮细胞完全覆盖支架内腔的最合适时间是2 d，功能和排列良好的内皮细胞可以抵抗住10 dyn/cm2持续搏动的血的流力量。但是，经过5周时间制作的支架的机械强度比较低，而且也不均一；制作效率低，一根血管有时只有一小段可用（约3～4 cm）。

剪切应力对血管（尤其是血管细胞）的影响非常大，在生物反应器内，可以更精确地研究剪切应力与细胞生长的关系。Macario发现，人主动脉ECs在剪切应力10～20 dyn/cm2间生长及黏附良好；达到30 dyn/cm2时，6 h后细胞凋亡明显增加，原因是由于细胞支架的变化［24］。由于支架自身张力强度降低，导致部分区域受到的流体机械力发生变化，影响细胞沿流体方向排列，从而消弱了内皮细胞与支架间的黏附力，最终导致细胞脱落。而Inoguchi［25］发现，剪切应力存在的状态下可以提高ECs抵抗从生物材料分离的力，如果剪切应力逐渐增至8.7 dyn/cm2时，细胞形态学得以保持，与材料的黏附得以加强，但当达到19.6 dyn/cm2时，可以看到有细胞开始脱落。在作为外部因素的剪切应力诱导细胞的凋亡中，Fas/FasL基因发挥着重要作用。与此不同的是，Shirota在生物反应器内，进行的血管支架种植内皮细胞，设定泵的频率为70次/min，产生的流量为60 mL/min，作用于支架上的剪切应力为30 dyn/cm2［26］。在这种机械力学刺激下，内皮细胞呈长梭型、沿液体流动方向排列，而且细胞保持单分子层融合生长的状态，与自然血管类似，这些差异可能与各个实验室所采用的材料及设备的不同有关。

通过对血管中层的平滑肌细胞的研究，Engbers-Buijtenhuijs认为，持续的机械力对于在生物反应器内培养的 SMCs至少有3方面不同的影响：加速SMCs的生长、加速胶原纤维束的产生、诱导细胞的表型由综合状态向收缩状态转化［27］。在他进行的实验中发现，较静态培养，在生物反应器内搏动性血流刺激下，血管支架上的平滑肌细胞数量明显增加，细胞在支架材料上有更均匀的分布，有更多基质胶原的mRNA表达。在反应器内的培养，促进了营养物质的转运和代谢废物的排泄，而且较静态环境需要更多的氧代谢。

生物反应器能更好地为组织过程血管提供物质供应，一些研究表明，灌注法可以明显增加三维环境培养的支架上细胞密度［28-29］。持续的灌注可以使循环中的培养基携带足够的养分，同时可以运输更多的氧供应支架材料上的细胞，还可以清除代谢废物和代谢中产生的一些抑制因子。

目前已经有研究显示，生物反应器在提高组织工程血管机械强度方面有非常重要的作用。Hoerstrup在对小口径血管支架机械性的研究中发现：在搏动血流状态下的生物反应器内，支架的爆破强度在21 d后从最初的177.5 mmHg升高到326.3 mmHg；作为对照，同样的支架在静态环境培养，21 d后爆破强度从最初的178.8 mmHg降到50mmHg［30］。同样地，缝合强度生物反应器组比对照组高5倍。Hoerstrup的研究显示，生物反应器内种植的小口径血管支架达到了类似自然血管的组织，并且在机械强度方面也适应临床应用。

Niklason把猪的平滑肌细胞种植在可降解的聚乙醇酸支架上，在搏动性生物反应器内进行培养数周。在培养过程中，伴随着支架的降解，平滑肌细胞产生了大量的基质蛋白，同时发现搏动性力学环境的培养并不能提高SMCs的密度，但能够使肌球蛋白重链更强的染色，后者是SMCs成熟的最终标志物［31］。在培养的后期，把猪的内皮细胞种植在管腔内，从而使管腔面形成完整的内皮细胞层，这种组织工程血管在组织表现上与自然血管非常相似。这些组织工程血管的爆破压（burst pressure）达到2 000 mmHg，在移植猪体内保持24周的通畅，而非反应器内培养的对照组爆破力却不足300 mmHg。该组织工程血管的缝合强度虽已达到91 g，但仍低于自然血管。Niklason同时验证了支架的培养时间与承受力量之间的关系，在生物可降解支架PGA上种植细胞，培养5周可以耐受570 mmHg的压力，而培养8周的可以耐受2 150 mmHg的压力。笔者最近进行了MSCs与可降解合成材料在生物反应器内构建组织工程血管的实验，发现在剪切应力作用下，MSCs向内皮细胞定向分化，为构建组织工程血管开辟了新的途径［32］。

人们对机械力刺激作用于细胞信号和机械力传导影响的不断深入理解，是未来研制理想生物反应器的基础。另外，在实验中对生物反应器内的组织或细胞进行实时分析、数学和计算机模式的不断引入，也是未来反应器发展的趋势。

虽然在生物反应器内构建组织工程血管取得了很大的进展，但许多问题仍需解决：如何使种植细胞的组织工程血管在生物反应器内更好地生长；如何改进生物反应器，使组织工程血管获得最佳的机械强度等。在把生物反应器作为一个常规设备用于临床之前，还有很长的路要走。

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