精子运动能力评价方法研究进展

尚可可，张西亚，韩胜利，李国翬

（1.天津大学 精密仪器与光电子工程学院，天津 300072；2.天津医科大学总医院 设备科，天津 300052；3.天津市计量监督检测科学研究院， 天津300192； 4.天津开发区奥金高新技术有限公司，天津 300072）

目前，全国育龄夫妇约2.3亿人，不孕不育发生率在15%～20%，男性不育的发病率呈逐渐增加的趋势,约占男女不育不孕的一半。男性不育的临床评估和基础研究的一项重要试验是精子受孕能力检测。

精子受孕能力是生育能力的重要指标，由于受精过程是一个复杂的理化反应过程，受到许多因素的影响，在实际操作中，直接测量体内受孕能力[1-3]比较困难、成本高、方法繁琐。而精子离体运动能力分析在某方面与精子体内受孕能力存在着良好的相关性，因此，精子运动能力是评价受孕能力重要的指标。

精子运动能力客观评价方法经历了最初的肉眼显微镜观察方法、光散射测量到计算机辅助精子运动特性分析，对精子运动能力评价越来越准确、越来越客观。本文对精子运动能力评价方法进行简单介绍。

1 传统人工精子运动能力分析

传统的人工精子运动能力分析由有经验的医生通过生物显微镜放大精液样本图像，观察一定数量的精子，计数一定的时间内精子运动经过的距离，然后计算平均值。这种人工的计数方法主观性强、准确性低、重复性差，而且操作医生需要经过特殊训练和长期实践。

随后出现定时曝光技术，采用暗视野显微镜对运动中的精子进行定时曝光拍照，根据不同精子留下的轨迹长度，可以求出它们运动速度的快慢。该方法缺点是曝光时间太长、轨迹粗重、重叠后不易辩认。如单纯缩短曝光时间，精子运动的轨迹又太短，难于比较运动的差异。

为了克服定时曝光技术的问题，多次曝光技术被采用。在光源与视野之间加一个黑盘，上面有6条狭缝透光，在1s曝光时间，黑盘转一圈，这时精子的运动轨迹就成了6个连成串的亮圆圈，克服了上述缺点。该方法在一些临床和研究单位仍被采用。

2 激光光散射测量法

激光光散射方法是通过分析精子散射光光谱获得精子的运动特性。激光器发射的光经滤光片衰减后，照射精子发生光散射，根据光学多普勒效应，精子活动速度决定散射光的光谱。通过频谱分析，可以得到精子运动速度平均值及速度分布函数等运动指数。该方法可以无害地同时对数百个精子运动速度进行实时、在线评价，完全排除主观因素。

宋传琳等[4]在上世纪90年代已经开始研究该方法，基于该方法，经过1000多例临床研究，证实了正常人精子运动速度平均为35μ m/s，多数不育病人的精子运动速度偏低，平均为31μ m/s，低于28μ m/s者可认为精子活力不正常。

该方法设备简单、技术成熟、已得到较广泛应用。然而，该方法只能测得精子运动指数，不能得到精子形态及运动姿态等参数。精子形态是精子的重要特征,近年来国际上非常重视人类精子的形态学分析。体外受精研究表明,正常形态精子数量与受精率呈正相关,畸形精子很少能结合到卵透明带上[5]。

3 精子动态特性计算机自动分析方法

近年来，随着计算机技术和图像处理技术的发展，计算机辅助精子运动能力分析(CASA)方法得到迅速发展。该方法是将显微镜下精子图像采集到计算机中，结合图像处理技术，实时、在线显示分析精子的形态和运动轨迹。在此基础上计算WHO手册规定精子曲线运动速度（VCL）、直线运动速度、精子密度、精子活率等参数[6]。通过多元方差分析获知精子活动的模式、活力和耐力的综合情况。

CASA方法测量结果受系统参数[7]、图像采集时阈值设定[8]、图像采集卡性能[9]、图像处理算法[10]等因素的影响，采用该方法进行测量需要建立严格的取样、操作流程，测试时温度严格保持在25～35℃，精子计数板深度为8～10μ m。

为了对CASA方法客观评价，进行了一系列对比试验。宋传琳等采用CASA方法与激光散射方法进行对比实验，发现两种方法测量结果有很高的相关性[11]。Rajinder S. Sidhu[12]采用CASA方法与人工观测进行对比实验，实验表明：当精子浓度低于20×106/mL时，CASA方法和人工检测的结果偏差较大；当样本经过冷冻复苏， CASA检测结果偏低。Mathew James Tomlinson[13]对已知浓度的模拟介质进行实验，结果表明：CASA检测结果比人工检测精度和准确性要好。因此该方法为医学临床和科研提供了一种客观、定量、准确的测试手段[14,15]。此外，该技术还在各类动物检测中有广泛运用[16]。

CASA系统包括显微成像部分、光电图像转化部分和图像处理及分析部分。前两部分技术较为成熟，目前研究工作主要集中在精子目标追踪算法及目标识别[17]。其中，杂质的有效识别和精子密集区的多精子跟踪是难点。CASA系统使用时，杂质包括小气泡、环境的固态杂质和精液自身杂质。环境的固态杂质和精液自身杂质，和精子面积差别大，容易筛除，而小气泡和精子不论面积还是图像灰度十分接近，难于区分，最好的解决方法是采用荧光标记的方法来区分。

CASA系统总体来说技术较为成熟，目前处于产品研发阶段。各机构在产品的易用性和智能性方面进行了深入研究。

4 发展展望

分子生物学研究深入和检测技术发展，使精子检测从宏观向微观发展。光谱检测技术为监测精子内部成分变化提供了手段，Aleksander Giwercman[18]研究了精子活力和染色体结构的关系，徐德祥[19]采用原子吸收光谱检测血清和精液中硒浓度。

随着人工授精技术发展，单个精子质量评价越来越受瞩目，采用光镊技术[20]结合拉曼光谱对单个精子进行操控和进行分子层面的检测成为该领域研究热点。

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[20]BING SHAO,NASCIMENTO Jaclyn M,SHI Linda Z.Automated Motile Cell Capture and Analysis with Optical Traps[J],Methods in Cell Biology, 2007, 82:601-627.