AFLP分子标记技术在昆虫学研究中的应用及展望

李艳梅, 梁革梅, 赵奎军*, 郭予元

(1.东北农业大学农学院,哈尔滨 150030;2.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

近十年来,现代分子生物学技术的迅猛发展,尤其是PCR的出现,引起了DNA遗传分析的一场巨大革命。以PCR为基础的DNA指纹技术大大加快了人类研究遗传多样性的步伐,为不同来源和不同复杂程度基因组的分析提供了有力的工具。扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)AFLP技术是由荷兰Keygene公司的两位科学家Zabeau和Vos于1992年创立的,于1993年获欧洲专利局专利,该技术以 RAPD和RFLP技术为基础,用其长,弃其短,从而成为一种精确、有效的分子标记方法。它的基本原理是首先利用可产生黏性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列,产生不同长度的酶切片段。然后,将这些酶切片段与含有与其有共同黏性末端的人工接头连接,形成模板。为达到选择扩增的目的,再按照模板序列,在引物中添加具有选择性的核苷酸(1～3个),然后PCR扩增,结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,根据凝胶上DNA指纹的有无来检出多态性,也可以通过自显影技术或者荧光的方法来检测。

AFLP标记与其他标记如 RAPD、RFLP、SSR(微卫星)相比具有许多优点。相对于其他技术,在整个基因组水平上,AFLP技术不仅具有高重复性,高分辨率,高灵敏性[1],而且它能够一次同时扩增50～100条带。另外,扩增不需要预先知道序列信息[2]。因此,虽然该技术自创立开始首先运用于植物分子生物学的研究中,但因其具有上述优点,同时还易于标准化,很快被推广到生物学的各个领域,如遗传图谱的构建,遗传多样性分析、基因或基因组区域特异性标记的筛选和定位、细菌鉴定及疾病诊断和肿瘤研究等。近年来该技术又在酶切、扩增体系、检测和分析方法等方面不断得到改进,更为广泛地应用于多种生物的不同研究领域。

近十年来,AFLP技术受到了昆虫学研究人员的青睐,已在昆虫学多个研究领域得到了较为成功的应用,主要用于生物多样性、种群遗传分析、连锁图谱构建等方面。本文简要介绍了AFLP分子标记技术在有益昆虫、重要农业害虫、检疫害虫等研究中的应用,并对该技术在昆虫学研究中应用的前景进行了展望。

1 AFLP技术在有益昆虫中的应用

1.1 种质资源鉴定以及系统进化研究

家蚕(Bombyx mori L.)是重要的经济昆虫,作为分类学上的一个物种,从地理来源上分为中国系统、日本系统、欧洲系统和亚热带及热带系统等4大系统,有500多个品种,其生态和经济性状各具特征。研究家蚕不同地理品种分类、进化、亲缘关系和遗传差异是家蚕种质资源鉴定、保存和利用的依据,也是品种培育和推广的理论基础。近年来,DNA分子标记技术的迅速发展为家蚕品种遗传多样性的评价提供了新的途径。其中,AFLP分子标记技术具有多态性检出能力强和结果稳定可靠的特点,非常适合品种多样性检测和品种鉴定。

鲁成等[3]利用AFLP分子标记技术,对我国不同地区野桑蚕、家蚕和柞蚕进行了系统学研究和品种遗传多样性研究,对33个具有代表性的家蚕不同地理品种,以及浙江、陕西、重庆、江苏、湖北、湖南、辽宁等10个地区的野桑蚕和5个柞蚕品种进行了DNA多态性分析和分子系统学研究。

张金卫等[4]利用AFLP分子标记技术对浙江省生产上应用的6个家蚕品种(包括正反交)进行了DNA指纹分析,筛选出5对引物,在6个家蚕品种中扩增出157条带,其中有多态性带54条,且这些条带组合对特定品种的引物是稳定的,试验具有重演性。建立的方法可准确地将供试的6个家蚕品种全部区分开来。初步建立起利用DNA指纹来进行家蚕品种鉴别的模型,可为保护家蚕育种产权,登录新品种,以及鉴定和检测蚕种的真实性和纯度,仲裁蚕种纠纷等提供客观、科学的技术依据。

1.2 遗传图谱的构建与功能基因标记定位

家蚕不仅是一种重要的经济昆虫,也是生物学研究的极好材料。家蚕遗传连锁图谱是基础理论研究和实际应用的中间桥梁,是家蚕资源、育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基础。研究人员利用AFLP标记纷纷建立遗传图谱,并对重要经济性状进行了标记定位。其中 Tan等[5]利用AFLP技术首次对家蚕BC1群体进行了分子连锁图谱的构建。用35组引物在家蚕品系782和od100的回交子代中得到了1248个分离位点,其中545个在BC1群体中符合1∶1分离比,构建的AFLP遗传连锁图中含356个标记,构成30个连锁群,每个连锁群包含4～36个标记,平均为11.9个标记,每个连锁群长度为37.4～691 cM之间,总的遗传图距为6512 cM,标记间的平均距离为18.2 cM。并对性染色体上的基因od进行了定位。万春玲等[6]、朱玉芳等[7]也分别利用AFLP标记构建了家蚕分子连锁图谱。

鲁成等[8]利用AFLP技术,对家蚕品系 C100和大造的回交一代BC1群体进行了连锁图谱的构建。构建了一张含有408个标记位点,33个连锁群,总图距为3676.7 cM,平均图距为111.4 cM 的连锁图谱,标记间距离为0.0～119.9 cM,平均间距9.1 cM。并将绿茧基因Gc定位在该图谱的第22连锁群的L-P4T6-107与 L-P6T4-84之间。在此基础上分析了影响家蚕的全茧量、茧层量、茧层率和蛹体重4个重要经济性状的QTL。通过复合区间作图分析共检测到11个QT Ls,其中控制全茧量的QT Ls有2个,分别定位在第6、19两个连锁群上;控制茧层量的QTLs有3个,分别定位在第3、14、19连锁群上;控制茧层率的QTLs有3个,分别定位在第2、11、15连锁群上;控制蛹体重的 QT Ls有3个,分别定位在第2、14、19连锁群上。

Sima等[9]以F2代91个个体作为作图群体,为家蚕茧质性状的QTLs定位构建了一张较高密度的AFLP分子连锁图谱。692个有效位点中的550个构成了a和b亚群,其中a亚群21个连锁群含233个标记,b亚群为28个连锁群含317个标记。a、b亚群中各连锁群上标记数目变化范围在4～43个和3～35个,连锁群总长度为1868.10 cM 和2677.50 cM,连锁群的长度变化在22.3～424.3 cM和2.4～366.5 cM,标记的平均图距变化在3.39～17.43 cM和0.80～26.96 cM,位点间的平均距离为8.81 cM和9.26 cM。平均图距小于10 cM的连锁群有14个和18个,大于10 cM小于20 cM的连锁群有7个。连锁群上位点平均数为11.1个和11.31个,连锁群的平均长度为89.0 cM和95.6 cM。a,b亚群平均总长为2272.8 cM,平均图距9.06 cM。符合QTLs定位的基本要求,为后一步的QTL定位和分子标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)模型的建立奠定基础。

1.3 AFLP用于社会昆虫行为学研究

社会昆虫的行为可塑性代表着一个复杂的生物学现象,引起分子生物学家的广泛关注。蜜蜂成为分子生物学家在分子水平上研究昆虫社会行为的模式种[10]。AFLP分子标记和微卫星技术已被用于研究蜜蜂的保卫行为和刺吮行为[11]。Ruppell等[12]研究了蜜蜂的授粉行为,验证了前人研究的3个QTL标记和1个候选基因,同时采用2个相互回交的种群,每个种群利用400多个AFLP标记,从而标记出2个新的QT Ls。该研究结果表明了蜜蜂食料行为遗传体系的复杂性,明确地支持了 pln1,pln 2,pln 3,Amf or这4个基因包括在蜜蜂食料行为规律中的假定,并且增加了某些新的值得以后进一步研究的影响蜜蜂食料喜好行为的因子。

2 AFLP技术在重要农业害虫中的应用

2.1 重要害虫基因标记以及抗药性研究

害虫抗药性是日益紧迫的世界性问题,对一种或多种农药产生抗药性的昆虫及螨类已经超过440种。害虫的抗药性问题使农业生产蒙受了巨大的损失,因此,关于抗药性的监测、检测、机理、评价、治理等越来越得到人们的普遍关注。进入20世纪90年代,随着分子生物学技术的发展,在DNA分子水平上,快速简便地检测与抗药性有关的基因突变成为可能,越来越多的抗性相关基因被发现、测序及克隆,使人们能够在分子生物学和分子遗传学的水平上进一步了解害虫的抗药性机制,这将对了解害虫的抗性机制起到极大的推进作用。随着研究的进一步深入,必将很大程度上增加人们对害虫抗药性的预测和预防能力。

AFLP技术是以PCR为基础的多位点指纹技术[13],具有稳定性好和多态率高等特点,已经被成功地应用于多种害虫基因的标记[14-15]。由于该技术能检测出较为丰富的多态性信息,因此在昆虫学研究中,通常应用于重要农业害虫的遗传作图,以便定位或发现一些与抗药性相关的基因[16-18]。小菜蛾作为一种世界性的蔬菜害虫,对多种农药都产生了不同程度的抗药性,并且它是第1个被发现在田间对Bt毒素产生抗性的害虫[19]。Heckle等[20]将AFLP分子标记方法用于小菜蛾对Bt毒素的抗性遗传研究,以抗性亲本和敏感亲本回交的后代为作图群体,构建了含有207个AFLP标记,31个连锁群的小菜蛾抗性遗传图谱,利用鳞翅目遗传连锁的双相特征,将抗性基因BtR-1定位在第7连锁群上,Heckel所提供的这个有力的工具促进了对Bt抗性的了解、检测以及治理研究,为研究人员开展鳞翅目害虫抗性机理研究提供了参照。

自从1996年转Bt基因棉花在我国推广种植以来,棉花上的主要害虫—棉铃虫的危害得到了有效的控制,虽然到目前为止还未发现棉铃虫在田间对Bt毒素产生抗性,但是梁革梅等[21]报道,通过室内筛选可以获得棉铃虫对Bt杀虫剂、Bt毒蛋白和转Bt基因棉的抗性种群。随着转基因植物在世界各地种植面积的日益增长,深入研究昆虫对Bt的抗性机制,对于运用Bt制剂和Bt作物进行害虫综合治理以及延长转Bt基因作物的使用寿命尤为重要。中国农业科学院植物保护研究所棉虫组经过多年的实验室内筛选获得了对Bt毒素和Bt杀虫剂具有高抗性的棉铃虫种群,在此基础上,2007年张少平等以2971倍抗性品系BtR棉铃虫(室内用BtCry1Ac原毒素筛选75代)及敏感品系96S棉铃虫为材料,运用cDNA-AFLP技术筛选其差异表达基因,共得到201个cDNA差异片段,37个与已知功能基因表达了同源性,包括氨肽酶N、钙粘蛋白、碱性磷酸酶等,以及一些可能是棉铃虫抗Bt有关的新受体和蛋白酶[22]。2008年李艳梅等参照Heckel的方法,以高抗品系BtR及敏感品系96S回交的后代为作图群体,进一步利用AFLP标记技术构建了一张含有49个AFLP标记,13个连锁群的棉铃虫基因组抗性遗传图谱,将抗性基因BtR-gene定位在第4连锁群上(文章正在整理之中),这将为制定棉铃虫对转Bt基因棉的抗性治理方案,延长Bt棉的使用寿命、促进我国棉铃虫综合治理和棉花生产的持续发展提供理论依据。

2.2 害虫近缘种的鉴定以及遗传分化

DNA分子标记适合鉴定形态上具有姊妹种特征昆虫的遗传差异[23-25]。近年来,AFLP技术已经被用于近缘种的鉴定以及遗传分化的研究[26-27]。

棉铃虫和烟青虫在中国是同域分布、形态相似的两个烟夜蛾属近缘种害虫。在卵、幼虫、蛹期,甚至在成虫期通过外部形态特征区分它们都很困难也不可靠。Ming等[28]利用AFLP分子标记来研究棉铃虫和烟青虫这两个近缘种实验室种群的种间和种内遗传距离和遗传分化。结果表明,在利用9个引物对扩增的总共1963个AFLP分子标记中,777个(39.6%)是棉铃虫种特异性标记,602个(30.7%)是烟青虫种特异性标记,584个(29.7%)是2个近缘种的共有标记;棉铃虫和烟青虫平均每个引物对扩增的DNA多态性片段数差异不显著(p＞0.05),但棉铃虫平均每个引物对扩增的种特异性标记数却显著多于烟青虫(p＜0.05);棉铃虫和烟青虫的种内遗传距离分别为0.1230和0.1107,其种间遗传距离为0.1783;聚类分析表明AFLP分子标记完全能区分棉铃虫和烟青虫;另外,还通过计算多态位点百分率和预期平均杂合度估计了棉铃虫和烟青虫实验室群体的遗传多样性。本研究表明,AFLP是用来研究棉铃虫和烟青虫两个近缘种害虫遗传分化和遗传关系的可靠方法和技术,它能用来进行种的鉴定、分化性状基因的定位和克隆。

2.3 AFLP用于害虫种群基因流动研究

利用分子标记技术研究害虫种群之间是否发生基因流动对于农业害虫防治工作具有实际应用价值。对害虫种群遗传学知道得越多,就越能更好地回答所使用的防治方法是对整个种群都有作用还是只对种群的一小部分起作用的问题。AFLP分子标记数据衡量的昆虫种内或种间的基因流动和遗传变异对明确阐述种群结构和动力学是至关重要的[29-33]。

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是西半球一些国家玉米上重要的经济害虫,具有迁飞习性。Clark等[34]采用AFLP标记技术研究了较广地理范围内草地贪夜蛾的遗传变异水平。试验种群分别为玉米上20个种群,毛泡桐树上1个种群,柠檬树上1个种群,狗牙根草上1个种群,共23个种群。采集地为墨西哥、美洲大陆、波多黎各、巴西以及阿根廷5个地区。AFLP结果表明大部分遗传变异发生在种群内部而非种群之间,这说明种群之间存在微效基因流动,进而阐明西半球国家的草地贪夜蛾是杂种繁殖种群。

3 AFLP技术在检疫害虫中的应用

由于AFLP技术信息含量大,多态性丰富,所以能够为分类学家提供准确的、分子水平的分类依据,解决了形态分类所不能解决的问题。利用AFLP等分子标记方法对检疫性害虫的DNA信息进行鉴定,具有准确、客观的特点,鉴定周期短,对截获的早期昆虫如卵、幼虫、蛹,不具有明显形态特征时,无需将昆虫培养至成虫,即可直接提取其DNA用于鉴定。从而大大缩短鉴定周期,提高通关速度和检验检疫的效率。

地中海实蝇(Ceratitis capitata)为重要检疫性害虫。Corsini等[35]采用AFLP技术分析了智利不同地区地中海实蝇的遗传多样性,并且克隆了3个片段,结果表明,其均可以作为鉴别地中海实蝇与Ceratitis属其他种类以及果蝇属(Drosophila)昆虫的分子探针。Kakouli-Duarte等[26]应用AFLP技术成功地对实蝇科的地中海实蝇和纳塔尔小条实蝇进行了分离和鉴定。

4 AFLP应用前景

AFLP分子标记在昆虫学研究中最吸引人的应用可能是在昆虫-植物交互作用方面。分子标记在靶标和定位重要抗虫植物的抗虫基因方面具有非常好的功效,同时在定位与作物相互作用的昆虫无毒基因方面也非常有价值[36]。

标记数据产生的分子遗传信息被用来描述害虫侵害特定植物种类的表型能力特征。这方面应用的例子是水稻和小麦上的重要害虫瘿蚊,稻瘿蚊(Orseolia oryzae Wood-Mason),是亚洲南部以及东南部水稻上的主要害虫,由于种群出现不同的生物型,克服了寄主植物的抗性基因,每年造成约5亿美元的损失。类似地,小麦瘿蚊(Mayetiola destructor Say)在小麦上也造成严重的经济损失。在北美洲,尽管小麦育种领域已经开发了32个抗性基因以防治小麦瘿蚊,但是与小麦抗性基因相对抗的不同的有毒瘿蚊种已经进化,导致小麦作物每年平均损失约1亿美元。当前还没有合适的化学以及物理防治法来防治这类害虫,在这种情况下,研究人员采取的策略是使用分子遗传工具,弄清楚昆虫与寄主植物之间的相互作用。这有助于鉴定互作中的特定基因,开发出抗性基因,应用到抗虫植物开发中,以发展抗虫植物治理策略。

Behura等[37]采用AFLP分子标记,利用BSA(bulked segregant analysis)方法探索出一个AFLP标记,这个标记与和水稻抗性基因Gm2相互作用的稻瘿蚊 vGm2无毒基因相连锁。类似地,利用RAPD和AFLP技术结合BSA分析方法,还鉴定出几个重要的小麦瘿蚊无毒基因,这些基因与美国种植的小麦品种的抗性紧密相关[15,38-40]。这些研究工作有力地说明了AFLP分子标记方法有助于更好地了解害虫与寄主植物遗传交互作用机制理论以及进化基础。

5 展望

AFLP技术自20世纪90年代发明以来引起了研究人员极大的兴趣,它在种群遗传学,生态学以及进化学研究中成为一个非常重要的分子标记系统。近十年来,AFLP分子标记技术在有益昆虫、重要农业害虫以及检疫害虫等昆虫学研究领域已得到应用。然而,这项技术在昆虫学研究中的应用还处于初步阶段。由于AFLP标记通常是作为显性标记,因此,它很难区分杂合子和纯合子,所以除了尽快建立起该技术在昆虫学研究中的应用平台,对该技术进行不断地完善,减少人为误差之外,更应该深入学习AFLP数据统计分析方法,使其能够更加真实地反映基因组遗传信息,可能的话,可以结合多种分子标记方法,以期达到在分子水平上更好地了解昆虫的遗传、进化等方面信息的目的。

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