高分辨率熔解曲线分析技术及其应用进展

李 潇卢 瑶

高分辨率熔解曲线分析技术及其应用进展

李 潇①卢 瑶②*

高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技术发挥着重要作用。

高分辨率熔解曲线；基因；突变

[First-author's address]China Medical University,Shenyang 110001, China.

随着现代科学的不断发展与人类疾病谱的不断扩大，各种疾病在基因水平的研究越来越成为科研领域的热点。虽然目前已有许多技术广泛应用于医学基础研究，如直接测序、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、基因芯片、基因探针等，但都始终存在着通量小、操作复杂、易受污染等种种缺点，HRM技术的诞生解决了上述难题。

1 高分辨率熔解曲线

HRM分析技术是2002年由犹他大学和爱德华科技公司合作开发，最初应用于单核苷酸多态（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）检测分析的一项新技术[1]。它是在PCR结束后，根据不同碱基序列构成核苷酸熔解温度不同这一物理性质，在同一容器中直接进行高分辨率熔解，利用饱和染料监控核苷酸的熔解过程，得到特征性熔解曲线，再根据熔解曲线的形态变化来判断核苷酸性质的差异。目前，HRM的应用领域已经扩展到突变扫描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等诸多方面，近年来已成为生命科学研究中的热点技术。

HRM利用PCR后扩增子的核苷酸序列和长度不同而引起的各碱基含量的差异，通过不同温度下实时检测升温过程的熔解曲线来反映DNA链中单个或多个位点的基因变化。可以说，核苷酸的排列和配对碱基不同是其熔解温度产生差异的根本原因。HRM通过这种实时检测技术，判断升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况。双链DNA如果某SNP位点不匹配，升温过程中就会先解开，其熔解温度反映在熔解曲线上就会相应降低，根据荧光强度与温度曲线就可以判断是否存在SNP，而且不同基因位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能有效区分不同位点的基因型。

2 HRM分析技术的应用进展

2.1 SNP分析

不同个体同一条染色体上同一位点的核苷酸序列绝大多数是一致的，当单个核苷酸碱基不同而导致核酸序列呈包括置换、缺失和插入等多态性时，称单核苷酸多态性，即SNP。SNP现象在生物体内广泛存在，它是生物遗传变异的表现之一，因而SNP对研究人类遗传和进化具有重要意义。

通过对比人群染色体上目的基因在温度变化过程中的多态性，即体现在熔解曲线上的波形峰值差异，来分析人群中特定位点不同碱基所占比率与某一性状或疾病的相关性，为进一步的基因筛查，疾病预防以及临床用药指导等方面的研究奠定基础。Vossen RH等[2]通过HRM分析69名个体的MBL2（编码一种先天免疫分子），发现了3处SNP位点，目前正在研究它们与炎症和感染性疾病的相关性。通过对β地中海贫血患者的血红蛋白进行SNP检测，可以高效准确地判定疾病分型，有利于准确进行临床诊断，避免误诊[3]。

也可以利用同一原理研究家族遗传过程中某一疾病易感性或家族遗传病是否与基因SNP有关，例如，当CYP2C19基因存在明显的遗传多态性时，机体易患真菌感染性疾病[4]。若确定了相关性可以深入明确基因定位，并应用于产前诊断，对提高人类整体质量水平具有重要意义。

另有报道许多人类相关疾病与基因多态性的关系。例如Jin XM等[5]研究PARP-1基因上两个SNP位点时发现，这两个SNP的五种多态性变化均可以不同程度地降低非霍奇金淋巴瘤的发病率。

2.2 突变扫描

HRM分析技术通过饱和染料监控熔解曲线的变化，仅利用核酸的物理性质对基因序列进行精确分析。基于这一原理，使HRM可以不受碱基突变位点和种类的局限，不仅能够对已知突变进行分析，而且对未知突变的筛查、扫描和短片段重复序列的分析也有理想的检测效果。突变扫描运用饱和染料，通过对比杂交双链与野生型基因曲线的形状差异来分析检测位点的突变情况，这种曲线形状的不同是由极微小的熔解温度变化来实现的。对比纯合子的标准熔解曲线进行基因突变检测，就可以比较出突变位点之所在。

目前，利用HRM进行突变扫描的应用非常广泛，科学家们发现了许多由于基因突变而导致疾病发生的现象。Hill等[6]利用HRM对比13位慢性肉芽肿疾病患者和96位正常个体的CYBB外显子时发现，此外显子的19个突变位点与X连锁慢性肉芽肿性疾病的发生有密切关系。利用HRM 进行肺癌EGFR基因突变检测可以显著增加突变检测的灵敏度，提高临床诊断速率[7]。Yan JB[8]证明6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏病与C1311T/IVS插入突变有关，阐明了世界约有4亿患者的最普遍的酶缺乏病之一的主要发病机制，为临床靶向治疗的研究提供理论依据。通过对结肠癌患者KRAS基因进行扫描时，发现有40%的患者都有突变位点[9]。另外，Onq DC等[10]通过研究结核患者的ahpC基因，发现当此基因发生突变时，会产生利福平和异烟肼（治疗结核药）抵抗，上述药物对aphC基因突变的患者治疗无效，这一发现为结核病的临床用药提供了价值。

应用HRM技术检测基因突变的报道还有很多，如RET基因，p53基因，苯丙氨酸羟化酶基因等，对这些基因突变的深入研究目前正在广泛进行，其研究结果在预防、诊断、治疗方面将会发挥积极作用。

2.3 甲基化研究

DNA 甲基化是发生在DNA碱基序列上的一种共价修饰。靶序列上甲基基团的存在可以影响转录因子的结合，引起转录抑制，从而使该基因的表达受到抑制。DNA甲基化是表型遗传修饰的重要组成部分，在细胞正常功能维持、遗传印记、胚胎发育和肿瘤发生中扮演重要角色。HRM技术为DNA甲基化状态的检测另辟蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样，原先未甲基化模板所产生的PCR产物比甲基化模板的Tm要低。HRM还能确定特定样品中甲基化的比例。将不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，制作出标准曲线，将样品的熔解曲线与之相比较，从而确定样品中甲基化的比例。

在哺乳动物中，D N A甲基化主要发生在5-CpG-3双核苷酸序列的胞嘧啶上。在人类基因组中，大约有60%～70%的CpG胞嘧啶是甲基化的，其程度因不同的物种和细胞类型而异。启动子区CpG岛的甲基化常常可以抑制该基因的转录，尤其是对于抑癌基因，凋亡相关基因，DNA修复基因等，启动子区域发生甲基化会影响功能的发挥。不同的肿瘤组织基因甲基化状态不同，可以作为早期检测，监测肿瘤形成的重要标志。Snell C[11]应用HRM技术证明了BRCA1和BRCA2基因启动子的甲基化水平与家族性乳腺癌的发生密切相关。

甲基化也可用于人类发育异常疾病的研究。如Angelman和 Prader-Willi综合征，是两种由于遗传父系或母系的异常甲基化基因而导致的神经发育异常疾病。应用HRM技术可以检测由于甲基化水平过高引起的Beckwith-Wiedmann 综合征和由于甲基化水平过低引起的Russell Silver 综合征。在产前基因诊断方面，可以应用HRM技术检测ERG甲基化状态作为无创性产前诊断唐氏综合症的基因标记[12]。

2.4 基因分型

目前，虽然已经有很多基因分型方法，但HRM闭管检测在临床检验、针对性诊断和个性化药物筛选等方面都有着很大的优势。早在1997年熔解曲线分析就已经应用于基因分型[13]，这种方法比基于等位基因特异性的方法优越性更强，可以在一定跨度的变温过程中同时区分不同等位基因。

人β球蛋白的HbC，HbS和HbE 3个基因型在113bp区域中，运用以往的技术很难将它们区分开，Herrmann等[14]应用HRM技术将β球蛋白的3个基因型分别检测出来。Minucci A等[15]应用HRM技术证明当葡萄糖苷酸转移酶的启动子区有纯合的TA插入时，会导致胆红素葡萄糖苷酸的大量减少，进而发展成家族性非溶血性黄疸，他们对启动子区基因分型的研究成功对基因的靶向治疗提供方向。

另外，HRM在人类(双倍体)和微生物(单倍体)的基因分型中得到应用的还有CDA、乳糖分解酵素、血色沉着病蛋白等。

2.5 序列匹配

在不需要完整的基因型，而只需知道DNA序列是否匹配的研究中，如：组织移植、亲子鉴定、法医鉴别等。通过l:1混合样品进行熔解曲线分析，如果样品完全匹配，那么两条熔解曲线在绝大多数重要参考位点应完全吻合；如果样品不完全匹配，就将形成不同杂合子而改变熔解曲线，由此可以通过这种方法来验证样品的基因一致性。

在器官移植中，需要对人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）进行基因分型，主要涉及到HLA-A、B、C、DR等几个位点。应用高分辨率熔解进行HLA序列匹配时，虽然两个个体之间的七个共同的等位基因HLA-A具有高度多态性，HRM仍能够快速进行 HLA高度多态性位点的类型及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的HLA基因型确认。

3 展望

饱和荧光染料的普及、未标记探针与实时定量PCR的结合，使得一个样品能在一次分析中完成检测、量化和基因分型等多方面的研究需要，若正确使用这个方法可以减少95%～99%的测序需要。而且HRM进行突变扫描时是无损伤的，所以如果用HRM进行一些样本鉴定时，可使用同一样本进一步鉴定或进行其他目的的实验而对结果无任何影响。综上所述，HRM技术具有广泛的应用前景，尤其是在临床诊断方面具有相当巨大的发展空间。将会广泛应用于动植物基因检测、食品安全、考古等诸多其他领域。

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High resolution melting curve analysis technology and application

LI Xiao,LU Yao

High-resolution melting curve (HRM) is a new genetic analysis technology based on single nucleotide polymorphism in the formation of different forms of melting curves.It has a very high sensitivity, which can detect single nucleotide differences. Meanwhile,it has a great deal of other advantages such as low cost, high throughput,rapid,accuracy and not subject to the limitations of testing sites which realizes closed tube operation.HRM analysis technology is playing an important role in the fields of mutation scanning,single nucleotide polymorphism analysis, methylation studies,genotyping, sequence matching and other aspects.The development of this method will surely have a far-reaching impact on the study of human genes.

High-resolution melting curve;Gene;Mutation

1672-8270(2010)08-0057-04

Q 754

B

李潇,女，(1989- ),中国医科大学临床专业，本科在读。

2010-05-11

①中国医科大学 沈阳 110001

②中国医科大学实验技术中心 沈阳 110001

*通讯作者：卢瑶,女，（1977-）博士，讲师。现就职于中国医科大学实验技术中心，研究方向：分子生物学。 luyao@mail.cmu.edu.cn

China Medical Equipment, 2010,7(8):57-60.