巨噬细胞移动抑制因子在不明原因早期复发性流产者血清、绒毛和蜕膜中的表达及意义

张 钰 李俊霞 顾 艳 李 奕

早期复发性流产(ERSA)是指妊娠 12周以前,连续发生2次或 2次以上的自然流产,临床发病率 3%～5%。排除临床上可查出的病因(染色体、解剖、内分泌及感染因素),仍有近 1/2的ERSA患者病因未明,称不明原因早期复发性流产(UERSA),是临床上难治性的不育症。随着生殖免疫学的发展,发现UERSA因母胎免疫调节异常所致。最新的研究资料显示,巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在胚胎种植和生长发育过程中起着极为重要的作用[1]。本文旨在探讨 UERSA患者血清 MIF水平及MIF-mRNA在绒毛、蜕膜组织中的表达水平,试图从母胎界面细胞免疫角度阐明 UERSA发病机制,为临床建立有效的监测指标和治疗方案提供理论依据。

资料与方法

一、一般资料

1.UERSA组 知情同意下选取 2008年 1～12月在天津医科大学第二医院计划生育门诊因 UERSA就诊的患者 30例。病例选择条件：连续发生至少2次早期自然流产,年龄 20～40岁,孕周为 7～12周,超声检查证实胚胎发育停止或枯萎孕卵、无原始胎心搏动;夫妇外周血染色体核型检查正常;妇科检查、超声、子宫输卵管造影排除生殖器官畸形;性激素、甲状腺功能、血糖、胰岛素等内分泌检查均正常;排除生殖道感染性疾病,如支原体、衣原体等感染;优生 5项(TORCH)检验均为阴性;自身抗体(抗心磷脂抗体)阴性,部分凝血活酶时间正常;男方精液常规检查无异常。

2.正常早孕组 知情同意下选取自愿要求终止妊娠的健康早孕妇女 30例,年龄 20～40岁,孕周均在 7～12周,有 1次正常生育史,无自然流产或早产等不良孕产史。本次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产症状和体征;超声检查证实胚胎发育正常,见胚芽和胎心搏动,接收当日进行吸宫手术。

二、实验室检测

1.血清MIF测定 两组均在吸宫术前空腹抽肘静脉血5ml加入促凝管中,上下混匀数次,室温静置 2h后,2 500r/m in离心 15min后,取上清液,置于 -80℃冰箱冻存待测。

2.绒毛、蜕膜组织中 MIF-mRNA的表达 两组均于吸宫术中取样,于无菌条件下取绒毛、蜕膜组约 0.3g,立刻用DEPC水冲洗,迅速投入液氮,继之保存于 -80℃低温水箱中。RNAiso Plus抽取绒毛、蜕膜总RNA,cDNA合成按照逆转录试剂盒说明书进行。实验所用引物应用引物设计软件 Gene runner自行设计,由六合通生物技术有限公司合成。序列如下：β -actin：FW 5′-GCAAAGACCTGTACGCCAAC-3′,RV 5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′;MIF： FW 5′-CGCAGAACCGCTCCTACAG-3′,RV 5′-GCGTTCATGTCGTAATACTTGATG-3′。 总反应体系 20μl。 实时定量 PCR用SDS211软件进行,选择相对定量模式,每个标本均作 2个重复孔。PCR循环条件：95℃预变性 10s,温度变化速度为20℃/s;95℃ 5s、60℃(Cyclophilin 55℃)20s、 72℃10s,进行 40个循环,温度变化速度为 20℃/s。在每个循环的延伸末检测荧光信号。随后是升温程序：95℃ 0s,65℃ 15s,95℃ 0s,温度变化速度为 0.1℃/s,绘制PCR产物的熔解曲线。PCR结束后,分析各孔CT值(模板扩增到一定量拷贝数时即处于指数上升期所需反应循环数大小)。根据 2-△△CT法,得出目的基因的量等于 2-△△CT的值。

三、统计学分析

结 果

一、血清MIF的水平

血清中 MIF浓度 UERSA组(10.98±3.02ng/m l)低于正常早孕组(16.53±4.34ng/ml),差异有统计学意义(P＜0.01)。

二、绒毛、蜕膜组织中 MIF-mRNA的表达水平

UERSA组绒毛、蜕膜组织中 MIF-mRNA的 2-△△CT值为0.022±0.001,0.97±0.58;正常早孕组绒毛、蜕膜组织中 MIF-mRNA的 2-△△CT值为 1.29±1.11,1.20±0.85。 UERSA组患者绒毛、蜕膜组织中 MIF-mRNA的表达均低于正常早孕妇女,差异有统计学意义(均 P＜0.05)。

三、血清MIF浓度与绒毛、蜕膜组织中 MIF-m RNA表达的相关性

UERSA组和正常早孕组血清中 MIF浓度与绒毛组织中MIF-mRNA的表达呈正相关(r=0.69,P＜0.05),与蜕膜组织中 MIF-mRNA的表达也呈正相关(r=0.71,P＜0.05)。

讨 论

一、MIF的来源和功能

1966年 Bloom和 David将由活化的 T淋巴细胞分泌的可抑制单核/巨噬细胞移动的细胞因子正式命名为 MIF。近年来,随着体内 MIF蛋白分离、纯化和MIF cDNA克隆的成功,人们对MIF的产生有了更深入的认识。现已证实 MIF在腺垂体细胞、活化的T淋巴细胞、单核/巨噬细胞等细胞中高表达产生。巨噬细胞是 MIF的主要来源,MIF作用的靶细胞主要为巨噬细胞。巨噬细胞作为机体免疫反应中的重要角色,不仅参与非特异性免疫防御,而且是特异性免疫应答中一类关键细胞,它可以直接吞噬抗原异物,而且能呈递抗原,分泌多种细胞因子和直接杀伤肿瘤细胞,广泛参与免疫应答、免疫效应与免疫调节,在许多疾病的病理变化中起关键作用。MIF具有多种生物活性,主要是抑制巨噬细胞游走,促进其在炎症局部浸润、增生,并促使巨噬细胞分泌多种细胞因子及化学物质(如白介素 -1、肿瘤坏死因子 -a、一氧化氮),共同参与调节炎症反应和机体免疫[2]。

二、UERSA患者血清 MIF水平变化的意义

近年来,随着免疫学研究的深入,逐步认识到 UERSA的发生与母胎界面局部细胞功能和细胞因子表达关系密切。目前,已知与妊娠相关的许多细胞因子的主要功能和作用机制,但针对MIF在正常妊娠和流产发生中的作用还鲜为报道。Arcuri等[3]报道,在子宫蜕膜的活性细胞、腺上皮细胞、间质细胞及滋养细胞中均有MIF的表达,表明在胚胎植入期及发育期,该细胞因子扮演了重要角色。Yamada等[4]研究表明,一些胎儿染色体核型正常而反复流产的妇女,与有反复流产史但已有活产的妇女相比,早孕时期,前者血清中 MIF浓度有极显著下降,与正常妊娠相比也有显著差异,故推测她们早孕期间血清MIF浓度下降与流产相关。本研究也证实,UERSA组血清中MIF浓度较正常早孕组降低,差异有统计学意义,由此推测 MIF在妊娠的建立和维持中起着重要作用,是有助于建立早孕的因子,MIF的降低可能导致流产的发生,但具体作用机制还有待进一步研究。

三、绒毛、蜕膜组织中 MIF-mRNA表达下降与 UERSA发生

母胎界面-蜕膜面富含母体来源且蜕膜浸润的免疫活性细胞和胎儿来源的滋养细胞,它们通过分泌细胞因子构成复杂的细胞间信息网络,进行母胎间的免疫对话,形成有利于维持正常妊娠的免疫微环境。蜕膜免疫活性细胞主要由NK细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞组成。已有研究证实,MIF可提高巨噬细胞在种植部位的浓度,激活巨噬细胞,增强其黏附力和吞噬作用,触发吞噬活性破坏细菌,但不破坏胎盘细胞,保护胚胎免遭感染,激活的巨噬细胞在滋养细胞的诱导下还会分泌促进滋养细胞生长和发育的细胞因子[5]。Ap te等[6]研究证实MIF属于免疫抑制细胞因子,具有Th2型细胞因子的作用,MIF对胚胎植入时的细胞免疫有抑制作用,通过阻止自然杀伤细胞(NK细胞)释放细胞毒性穿孔颗粒而发挥其抑制NK细胞活性的作用,从而抑制活化的 NK细胞溶解滋养层细胞,使母体子宫接受胚胎。Bacher等[7]认为母胎界面MIF还参与调节母体 T细胞激活和维持母胎界面 Th2型免疫,Th2型免疫偏移对正常妊娠胎盘的生长是必要的,对胚胎植入和妊娠维持有重要意义[8]。最新研究还证实,MIF除调节炎症和免疫功能外,也促进细胞生长分化和新生血管的形成,对妊娠建立后滋养细胞的增殖,胚胎的正常分化、发育和胎盘血管的生成可能有非常重要的作用[9]。

目前国内外文献尚未见关于 MIF在UERSA患者母胎界面的蜕膜、绒毛中表达水平的研究。本研究表明,UERSA患者母胎界面的蜕膜、绒毛中 MIF-mRNA的表达水平均较正常早孕妇女降低,表明这种异常,可能影响了滋养细胞与母体免疫细胞之间的免疫对话,不利于母胎界面的免疫微环境发生正常妊娠的改变,导致母胎界面免疫耐受的格局被打破,最终导致了 UERSA的发生。

四、血清MIF水平和绒毛、蜕膜组织中 MIF-m RNA表达的相关性及意义

本研究显示,UERSA组血清中MIF浓度较正常早孕组降低;血清MIF水平和绒毛、蜕膜组织中MIF-mRNA表达呈正相关性,表明妊娠期母体血清MIF主要来源于胎儿胎盘循环,MIF的低血清浓度提示其可做为预测 UERSA发生发展的有效监测指标。

总之,通过上述研究结论提示 UERSA患者母胎界面蜕膜、绒毛MIF表达异常,可能在UERSA发生发展中起重要作用。我们可以尝试对既往有 UERSA病史的患者进行血清MIF筛查,血清 MIF水平降低者可预防性给予 MIF或其人工合成类似物治疗,可能提高其妊娠成功率,这将给 UERSA的预测和治疗带来新的突破。

1 ViganòP,Cintorino M,Schatz F,et al.The role ofmacropnhagemigration inhibitory factor in maintaining the immune privilege at the fetal-maternal interface.Semin Immunopathol,2007,29(2)：135～150.

2 梁婷,侯桂华.巨噬细胞移动抑制因子研究进展.国外医学临床生物化学与检验,2004,25(2)：188～190.

3 Arcuri F,RicciC,Ietta F,et al.Macrophage nigration inhibitory factor in the human endometrium：expression and localization during themenstrual cyc le and early pregnancy.Biol Reprod,2001,64(4)：1200～1205.

4 Yamada H,Kato EH,Morikawa M,et al.Decreased serum levels of macrphage migration inhibition factor in normalchromosome karyotype.Hum Reprod,2003,18(3)：616～621.

5 Fest S,Aldo PB,Abrahams VM,et al.Trophoblast-macrophage interactions：a regulatory network for the protection of pregnancy.Am J Reprod Immunol,2007,57(1)：55～ 66.

6 Apte RS,Sinha D,Mayhew E,et al.Cutting edge：role ofmacrophage nigration inhibitory factor in inhibiting NK cess activity and preserving immune privilege.J Immunol,1998,160(12)：5693～5696.

7 Bacher M,MetzCH,Calandra T,et al.An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in Tcell activation.Proc Natl Acad Sci U SA,1996,93(15)：7849～ 7854.

8 Bulla R,Fischetti F,Bossi F,et al.Feto-maternal immune interaction at the placental level.Lupus,2004,13(9)：625～ 629.

9 Bondza PD,Metz CN,Akoum A.Macrophagem igration inhibitory factor up regulates alpha(v)beta(3)integrin and vascular endothelial growth factor expression in endometrialadenocarcinoma cell line Ishikawa.JReprod Immunol,2008,77(2)：142～151.